L－型鈣電流在血管緊張素Ⅱ誘導新生大鼠肥大心肌細胞中的功能和分子水平改變

閆秋麗

(武漢大學基礎醫學院，湖北武漢430074)

在壓力負荷和神經體液刺激作用下，心肌細胞產生適應性肥大生長，以暫時性改善心臟功能。但這種心臟適應性肥厚能夠使心血管發病率和死亡率增高，這主要與其引起的電生理重塑和心律失常有關［1］。心臟的電生理重塑通常表現為復極化過程延遲而致動作電位時程(action potential duration，APD)延長等，其機制涉及到多種離子通道的改變和內外向電流的平衡，包括L型Ca2+電流這種內向離子流的變化。

在壓力負荷導致的心肌肥厚中有多種神經體液因素參與，其中血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是重要的體液因子。研究發現，血管緊張素Ⅱ能調節心肌細胞中多種離子電流或通道的功能，增強成年動物心肌細胞的L－型鈣電流(L－type Ca2+current，ICa，L)［2］。而在人和雞胚胎心肌細胞上，AngⅡ卻是增強胚胎心肌的T－型鈣電流，而減弱 L－型鈣電流［3］。因此，AngⅡ對胚胎心肌 L－型鈣電流的作用似乎與對成熟心肌的作用相反。而電壓門控性鉀電流在很大程度上決定了心肌細胞動作電位時程。鉀通道的功能失調可導致室性心律失常，如:尖端扭轉型室性心動過速(torsades de pointes)和長 Q－T 綜合癥引起的室性纖顫［4］。有報道稱，AngⅡ也可抑制心肌細胞緩慢激活的延遲整 流 性 鉀 電 流 (slowly－activating delayed－rectifier K+current，Ik，s)，而增強快速激活的延遲整流性鉀電流(rapidly－activating delayed－rectifier K+current，Ik，r)［5，6］。Ang Ⅱ調節各種跨膜離子流作用的存在，提示AngⅡ也可能促進了心肌電生理重構過程。事實上，AngⅡ被證實可增強培養心肌細胞縫隙連接蛋白connexin43的表達［7］。這種縫隙連接蛋白在心肌細胞間動作電位傳導中起著關鍵作用。AngⅡ還可抑制心肌細胞Kv4.3通道蛋白的表達，減少心肌鉀電流Ito;抑制心肌細胞Na+通道蛋白的表達，減少心肌Na+電流密度［8］。

為了探索AngⅡ誘使心肌細胞肥大時，心肌細胞L－型鈣電流的功能特征和分子表達水平，本實驗擬在培養的新生大鼠心肌細胞上，觀察AngⅡ所誘導肥大心肌細胞中L型Ca2+通道的功能特征和分子表達水平的變化，以便為闡明病理情況下心肌電生理重構機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

MilⅡ－Q純水機:MilliPore公司制，普通4℃與－20℃冰箱。YS－1300－V 超凈工作臺。DGG－9249電熱恒溫干燥箱:壓力蒸汽滅菌器:CO2恒溫培養箱:日本SANYO公司。精密天平(Sartorius BSⅡ110S)。BeideSH－5型磁力攪拌器，pH測定計，電熱恒溫水浴箱，Olympus IX71倒置顯微鏡:日本OLYMPUS公司。膜片鉗放大器:型號 Axopatch 700B，美國Axon公司。微電極拉制儀:Narishige P－97，日本。三維操縱器:Narishige，日本，紫外分光光度儀，低溫高速臺式離心機，PCR擴增儀，電泳槽和電泳儀，1008－0635(2012)05移液器等。

1.2 藥品與試劑

DMEM培養基:Sigma公司。胎牛血清:GIBCO公司。胰蛋白酶:GIBCO公司。D－Hanks液:鼎國自產。溴脫氧尿苷(BRDU):Sigma公司。多聚賴氨酸:Sigma公司。RNeasy Mini Kit:德國Qiagen公司。RT－PCR試劑盒:日本 Toyobo公司。DNA Marker:美國Promega公司產品。

1.3 實驗動物

將健康體質量250～300g的SD大鼠雌、雄各一只，合籠喂養。待雌鼠懷孕后，將其從籠中取出，待產。分娩后新生1～2d的健康SD大鼠仔鼠，用于實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1 新生大鼠心肌細胞分離、培養

取出生后1～2 d的SD新生大鼠，無菌條件下開胸剪取心室肌部分，D－Hanks液清洗去除殘血，將其剪碎，0.1%胰蛋白酶37℃反復消化直至獲得足量的細胞。每次消化5min，棄去第一次消化的上清，收集以后消化的上清，轉移到含有血清的DMEM培養基中以終止胰酶作用。300×g離心7min，棄上清取細胞沉淀加入含15%新生牛血清(NBS)的DMEM培養基制備成細胞懸液，在37℃，5%CO2培養箱中培養90 min，以差速貼壁法純化心肌細胞，以2×105/瓶的細胞密度接種至25ml培養瓶繼續培養72h開始實驗。培養的前72 h加入0.1mmol/L 5＇－溴脫氧尿苷以抑制非心肌細胞增殖。

1.4.2 心肌細胞肥大的誘導

心肌細胞接種72h后長成單層，可觀察到同步搏動。換液時在培養基中加入AngⅡ至終濃度10－7M，之后每24h換液并加藥一次，連續作用3d。設空白對照組細胞作相同換液處理，但不加AngⅡ。

1.4.3 心肌細胞總蛋白含量測定

心肌細胞肥大時，細胞內總蛋白含量會升高。因此，心肌細胞內總蛋白含量檢測時常被作為鑒定心肌細胞是否肥大的指標之一。本實驗參照南京建成生物工程公司考馬斯亮藍蛋白檢測試劑盒說明測定心肌細胞蛋白質含量，根據各瓶細胞數，計算出每瓶細胞的總蛋白含量。蛋白含量(mg/ml)=(測定管 OD值－空白管OD值)/標準管OD值－空白管OD值/標準管濃度/稀釋倍數。

1.4.4 電生理研究

細胞置于倒置顯微鏡上的恒溫灌流槽中，溫度控制在 22℃ ～24℃，先灌流標準臺氏液(mmol/L):NaCl 140，NaOH 2.3，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl21，HEPES 10，Glucose 10，pH 7.4。記錄L－Ca2+電流時細胞外液含(mmol/L):Choline－Cl 136，CsCl 5.6，CaCl22.0，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 5，和葡萄糖10，用CsOH調節pH至7.4。記錄L－Ca2+電流時電極內液成分(mmol/L):CsCl 20，Cs aspartate 110，HEPES 10，EGTA 10，MgCl21.0，Na2ATP 5，GTP 0.1，和磷酸肌酸 5，用CsOH調節pH至7.4。

記錄電極由自動拉制儀制備，充灌電極內液后的電極電阻為1～3 MΩ。用電動顯微操縱器將電極推向細胞，負壓吸引形成高阻封接，負壓吸破細胞膜，補償電容電流和串聯電阻(80% ～85%)以減少瞬時充放電電流和鉗位誤差，形成全細胞記錄模式。信號經 Ag－AgCl電極引導，由 Axon 700B膜片鉗放大器(Axon Instrument，USA)放大，經模/數轉換系統(Digidata 1322A)采集數據，并進行數據分析。信號經截止頻率為2 kHz的四階貝塞爾低通濾波器，采樣率為10 kHz，采樣后數據存于計算機硬盤內，供測量及分析用。于細胞破膜后5 min開始記錄ICa，L，使電極內液和細胞內液充分交換，減少了系統誤差。為消除細胞間誤差，電流值以電流密度(pA/pF)表示。以鉗制電壓為－50 mV，超級化－10 mV得到的細胞電容電流積分值，計算出細胞膜電容。細胞膜電容大小能反映細胞尺寸。

1.4.5 半定量RT－PCR

采用反轉錄－多聚酶鏈擴增反應法檢測種L－型Ca2+通道(α1C亞單位)的mRNA表達量。

(1)總RNA的提取:用Trizol試劑一步法，提取總RNA的、接觸組織的器具均經過0.5%DEPC水處理。①將培養皿中的培養液徹底棄干凈。將1 ml Trizol直接加在培養皿中的細胞上。將細胞并Trizol一起移入Eppendorf離心管中，勻漿。②室溫靜置5 min，再加0.25 ml氯仿搖勻。靜置5 min后，離心15 min(12000 g)。③水相移至新管，加0.7倍體積異丙醇，混勻。靜置10 min后，離心10 min(12000 g)，棄上清。④加75%乙醇1 ml(DEPC水新鮮配制)，混勻，再離心5 min(7500 g)。⑤蒸餾水溶解RNA。⑥分光光度計測A260/A28O比值為1.7～2.0。⑦1%瓊脂糖凝膠電泳觀察185與285條帶密度比值約等于2，確保RNA的純度和完整性。

(2)RT(逆轉錄):取逆轉錄cDNA產物2 μl，加L－型Ca2+通道α1C亞單位上下游引物(序列:Forward:5＇－CCTCAGTGCAGACACATTTGC－3＇，Reverse:5＇－CCGTTACAGCAG CACCCCCACA－3＇。由上海生物工程公司合成。擴增產物尺寸為253 bp)各2 μl及內參 GAPDH上下游引物(序列:Forward:5＇－ACGGCAAATTCAACGGCACAGTCA－3＇，Reverse:5＇－CTGGGGGCATCGGCAGAAGG－3＇。由上海生物工程公司合成。擴增產物尺寸為251 bp)各 2 μl，2 × PCR Master Mix(Fermentas)12.5 μl，滅菌水 2.5 μl，總體積為 20 μl。擴增反應條件為:94 ℃，30 s，58 ℃，40 s;72℃，1 min;30 個循環;完成全部循環后72℃ 10 min以達到充分延伸。

取RT－PCR產物6 μl進行2%瓊脂糖凝膠平板電泳，將電泳條帶圖像攝入凝膠成像分析系統，保存為tiff格式圖片，供分析。

1.5 數據分析

采用Origin 7.5 software(Microcal Software Inc.，USA)和 Clampfit 10.0 software(Axon Instruments Inc.，USA)軟件分析電生理數據。電流強度的測定，以電流激活過程中剛出現時數值與電流達最大激活時數值之間的差值為準。電流密度大小即為電流強度與膜電容的比值(pA/pF)。

所有數據均以mean±S.E.M.表示。采用t檢驗和方差分析。P＜0.05被認為具有統計學差異。

2 結果

2.1 各實驗組心肌細胞總蛋白含量和膜電容值的比較

從表1可以看出，與正常對照組相比，AngⅡ組心肌細胞的總蛋白含量明顯增高(P＜0.01);應用AngⅡ1型受體阻斷劑Losartan明顯使心肌細胞的總蛋白含量恢復至正常水平。

與心肌細胞總蛋白含量改變一致，AngⅡ組心肌細胞也要高于正常對照組(P＜0.01);Losartan同樣能使心肌細胞的膜電容值恢復正常。膜電容值的升高反映了心肌細胞尺寸的擴大。

這些結果表明，AngⅡ誘導心肌細胞肥大厚模型建立成功了。

表1 各實驗組心肌細胞總蛋白含量和膜電容值

2.2 AngⅡ誘導的肥大心肌細胞中L－型Ca2+電流密度的改變

在形成全細胞封接狀態后，將細胞鉗制在－50 mV，給予指令電壓從－40 mV～+80 mV，波寬為300 ms的刺激，可記錄到一系列的ICa，L。當加入硝苯地平(3 μmol/L)，再給予上述刺激后，可見該電流被迅速抑制，說明該電流為 L－型Ca2+電流。圖1是實驗中記錄的典型L－型Ca2+電流曲線。實驗連續記錄 ICa，L15 min，未見明顯的“rundowm”現象。

如圖2A所見，AngⅡ組心肌細胞的 L－型Ca2+電流密度在－20～+40 mV范圍內明顯高于正常組。其中，0 mV處 AngⅡ組 L－型Ca2+電流密度(6.13 pA/pF)比正常組(4.03 pA/pF)增高52.2%(P＜0.01)。但L－型Ca2+電流激活電位和翻轉電位并沒有改變。Losartan可以使大鼠心肌細胞L－型Ca2+電流密度恢復至正常組水平。

圖1 記錄的典型L－型Ca2+電流曲線

2.3 AngⅡ誘導的肥大心肌細胞中L－型Ca2+通道動力學參數變化

穩態激活特征:記錄ICa，L穩態激活曲線時刺激方案與記錄I－V曲線的方案相同。穩態激活曲線是將I－V曲線轉換成膜電導后得到，用Boltzmann 方程:G/Gmax=1/{1+exp［(V－Va)/k］}進行擬合。其中，G是膜電壓為 V時的膜電導，Gmax為最大膜電導，Va為半數激活電壓，k為斜率因子，G=I/(V－Erev)，I為對應膜電壓V時的峰電流，Erev為通過I－V曲線測得的反轉電位。

如同圖2B所顯示，正常組、AngⅡ組、Losartan組三組的ICa，L激活曲線特征沒有明顯不同。三組的半數激活電壓Va分別為(－7.86±1.03)mV、(－8.15±1.21)mV、(－8.06±1.18)mV，P＞0.05。

穩態失活特征:記錄ICa，L穩態失活曲線應用雙脈沖刺激，鉗制電壓為 －50 mV，條件脈沖從－60 mV開始，階躍10 mV，時間3000 ms;隨后測試脈沖為10 mV，時間300 ms。穩態失活曲線是用 Boltzmann 方程:I/Imax=1/{1+exp［(V－Vi)/k］}進行擬合。其中，I為測試脈沖引出的峰電流，Imax為測試脈沖引出的最大峰電流，V為條件脈沖電壓，Vi為半數失活電壓，k為斜率因子。

圖2 三組細胞L－型Ca2+電流的I－V曲線和激活曲線，*P＜0.01 vs control

圖3 三組心肌細胞L－型Ca2+電流的穩態失活曲線

圖4 三組心肌細胞L－型Ca2+電流的復活曲線

圖5 三組心肌細胞L－型Ca2+通道α1C亞單位mRNA的表達水平。

結果顯示，正常組、AngⅡ組、Losartan組三組的失活曲線特征相近(圖3)。三組的半數失活電壓Vi分別為(－24.86±3.65)mV、(－25.55±4.01)mV、( －24.31±3.87)mV，P ＞0.05。

失活后復活特征:記錄ICa，L穩態失活后恢復曲線采用雙脈沖刺激，鉗制電壓為 －50 mV，給予+10 mV、時間為200 ms(P1)和200 ms(P2)的兩個方波刺激，兩刺激間隔時間為從50 ms開始，每次遞增50 ms，直至750 ms。分別記錄P1和P2對應的峰電流。計算復活電流指數(P2/P1)。以復活電流指數對兩刺激間隔時程作復活曲線。并用單指數方程:P2/P1=A1 exp(－t/τ)+A0 進行擬合。求出復活時間常數τ。結果顯示，正常組、AngⅡ組、Losartan組三組的失活后恢復曲線特征相近(圖4)。三組的復活時間常數分別為(115±13)ms、(120 ±25)ms、(118 ±24)ms，P ＞0.05。

2.4 AngⅡ誘導的肥大心肌細胞中L－型Ca2+通道α1C亞單位mRNA表達的改變

為了確認AngⅡ誘導的肥大心肌細胞中L－型Ca2+通道分子水平上的改變，我們采用RT－PCR檢測了心肌細胞中L－型Ca2+通道α1C亞單位的mRNA表達量。圖3A是RT－PCR產物的電泳條帶。如圖5A所顯示，AngⅡ組心肌細胞中α1C亞單位的mRNA表達量明顯高于正常組。為了進一步的實時定量檢測α1C亞單位的mRNA表達量，我們又做了Real－time PCR(實時定量 PCR)，定量檢測了α1C亞單位的表達量。實時定量PCR檢測結果進一步證實，AngⅡ組心肌細胞中α1C亞單位的mRNA表達明顯增高，高于正常組56.0%(圖5B)。

3 討論

3.1 AngⅡ誘導的肥大心肌細胞中L－型Ca2+通道的分子和功能水平改變

盡管目前已有一些實驗證實，AngⅡ可以調節心肌細胞 ICa，L電流［2，3］。但是，這些實驗并沒有探討AngⅡ對L－型Ca2+通道表達的影響。當前研究的主要新發現是，AngⅡ在引起新生大鼠心肌肥大的同時，增加心肌細胞 ICa，L電流和 L－型Ca2+通道α1C亞單位mRNA表達。

L－型Ca2+通道主要是由α亞單位和β亞單位構成［10］。單獨α亞單位表達即可形成功能性L－型Ca2+通道孔，是主要功能亞單位;β亞單位是調節性亞單位，它與α亞單位共表達，可以調節L－型Ca2+通道的功能特征。目前研究發現，在心室肌等工作細胞中表達的主要是α1C亞單位。在竇房結、房室結中還有少量α1D亞單位的表達。心臟組織中并無其他α亞單位類型。心臟的β亞單位主要是β2亞單位。基于上述發現，本實驗只檢測了培養新生鼠心室肌細胞的L－型Ca2+通道α1C亞單位的表達。

本實驗研究中，AngⅡ對新生大鼠心肌細胞ICa，L電流的影響是與其調節L－型Ca2+通道 α1C 亞單位表達的作用相互一致。AngⅡ所誘導的ICa，L電流密度增加可能與其促進L－型Ca2+通道α1C亞單位表達增加有關。另外，本研究也發現，AngⅡ雖然增加了心肌細胞ICa，L電流密度，但對L－型Ca2+通道的激活、失活、復活等通道門控動力學特征并無影響。因而，AngⅡ可能只是增加α1C亞單位的表達量，而對心肌細胞L－型Ca2+通道的其它亞單位構成類型并沒有影響。

在心肌細胞中，AngⅡ的作用受體至少有兩種，即血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin receptor type 1，AT1R)和血管緊張素Ⅱ2型受體(angiotensin receptor type 2，AT2R)［11］。大部分 Ang Ⅱ的作用是由AT1R介導的［12］。同樣，本實驗研究發現，AngⅡ增加新生鼠心室肌細胞ICa，L電流密度和L－型Ca2+通道α1C亞單位表達的作用也是由AT1R介導的。應用AT1R拮抗劑losartan能抑制的這些作用。

3.2 AngⅡ增加 ICa，L電流密度和 L－型 Ca2+通道表達的可能意義

Ang Ⅱ對 ICa，L電流密度和 L－型Ca2+通道表達的增強，可能增加心肌細胞動作電位時期跨細胞膜內流的 Ca2+量［13］，而增加細胞內 Ca2+負荷。這種Ca2+負荷加重(或稱Ca2+超載)可以導致觸發活動發生，引起心律失常［14］。這也許是血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)和血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin receptor antagonist，ARB)能夠對室性心律失常具有一定防治作用的原因［15，16］。

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