GC－MS檢測人體血液中速可眠的方法學(xué)研究

劉小川，雷亞寧

(1.嘉魚縣血防醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北嘉魚437200;2.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心)

速可眠具有鎮(zhèn)靜、催眠及抗驚厥作用，通常用于催眠，尤適宜于入睡困難者，也用于緊張、焦慮不安、過度興奮，以及麻醉前和手術(shù)前的鎮(zhèn)靜作用［1］。速可眠久用可產(chǎn)生依賴性［2］，故不可濫用。大劑量對(duì)心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)有明顯的抑制。過量可麻痹延髓呼吸中樞而導(dǎo)致死亡，當(dāng)血藥濃度超過7μg/ml［3］，即產(chǎn)生中毒反應(yīng)。日常生活中容易獲得，故在刑事案件中經(jīng)常遇到投用此類藥物作案的案例，臨床中誤服過量該類藥物的病例也時(shí)有發(fā)生，因此，檢測生物樣本中速可眠的濃度在臨床檢驗(yàn)和法醫(yī)毒物分析中具有重要的意義。

目前檢測方法主要有毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)［4］、氣相色譜法(gas chromatography，GC)［5］、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)［6］和高效液相色譜－質(zhì) 譜 法 (liquid chromatograph－Mass spectrometer，LC－MS)［7］。由于生物樣品中成分復(fù)雜，且速可眠藥物極性較強(qiáng)，CE、GC和HPLC方法難以滿足速可眠靈敏準(zhǔn)確的定量分析要求。與LC－MS目前常用的電噴射離子化質(zhì)譜法相比，GC－MS采用電子轟擊或化學(xué)電離方式，能減少生物樣品檢材成分復(fù)雜基質(zhì)的干擾［8］。本實(shí)驗(yàn)建立了GC－MS檢測速可眠的方法，利用氣相色譜毛細(xì)管柱的高分離性能和質(zhì)譜準(zhǔn)確的鑒定化合物的能力，采用選擇離子模式(SIM)定量，在減少了干擾物影響的同時(shí)，提高了檢測的靈敏度，取得了很好的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A/5975C氣相色譜－質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)，配有電子轟擊離子源(EI)及化學(xué)工作站;氮吹儀(大連依利特分析儀器有限公司)。速可眠標(biāo)準(zhǔn)品(1.0mg/ml)購自上海司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所;甲醇、乙醚購自天津四友精細(xì)化學(xué)試劑公司，所有試劑均為分析純，所有溶劑均用去離子水配制。

1.2 樣品前處理

取空白血液樣品1ml置于10ml離心管中，添加速可眠標(biāo)準(zhǔn)品2μl，加1滴1.0 mol/l HCl溶液使呈酸性(pH值2～3)，用乙醚3ml渦旋混合提取1min，離心使之分層，轉(zhuǎn)移出乙醚提取液于5ml試管中，殘留液中再加10%NaOH溶液2～3滴，使檢材呈堿性(pH值11～12)，用乙醚3ml提取殘留液，渦旋混合1min，離心使之分層，轉(zhuǎn)移乙醚層，合并乙醚提取液，于60℃水浴中揮發(fā)至近干，殘留物加50 μl甲醇溶解，取1μl進(jìn)樣。

1.3 色譜條件

色譜柱(HP－5MS 30m ×0.25mm ×0.25μm);進(jìn)樣口溫度:200℃;傳輸線溫度:280℃;色譜柱程序升溫:初始溫度100℃，保持1.5min，以25℃/min升到280℃，保持15min;載氣:氮?dú)猓懔髂Ｊ剑魉?.0ml/min;不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0μl。

1.4 質(zhì)譜條件

電子轟擊源(EI)，電子能量:70eV，離子源溫度:230℃，四級(jí)桿溫度:150℃;電子倍增器電壓:1326V;掃描質(zhì)量范圍:m/z 50～400;掃描方式:選擇離子掃描(SIM)模式;選擇離子分別為 m/z 168，195，239。

2 結(jié)果

2.1 血液樣品中速可眠的色譜圖和質(zhì)譜圖

分別按1.2節(jié)所述方法預(yù)處理空白血液和空白血液添加2μg/ml速可眠血液后，采用SIM掃描檢測，在保留時(shí)間7.38min處，空白添加血液液中出現(xiàn)速可眠色譜峰，色譜峰峰形較好，分離完全，空白血液中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品峰。圖1A、1B分別為空白血液和空白血液中加入速可眠標(biāo)準(zhǔn)溶液后按照本文建立的方法進(jìn)行測定得到的色譜圖，圖2為速可眠質(zhì)譜圖。其特征離子分別為 m/z 168，195，239。

圖1 空白血液(A)，空白血液加入速可眠的色譜圖(B)

圖2 血液樣品中速可眠的質(zhì)譜圖

2.2 線性范圍和檢出限

分別配制成含速可眠濃度為300、1000、2000、3000、5000ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行檢測，以速可眠濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖3)，得到線性回歸方程Y=295.9X－77533.1，相關(guān)系數(shù)為0.9907。結(jié)果表明血液中EtG濃度在300～5000ng/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，以信噪比(S/N)等于3計(jì)算方法的檢出限(LOD)，本方法的檢出限為30ng/ml。

圖3 速可眠的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度和添加回收率

分別向空白血液中添加3個(gè)質(zhì)量濃度的速可眠標(biāo)準(zhǔn)工作液，加標(biāo)水平分別為 400、1000、4000ng/ml，按照本文建立的方法進(jìn)行測定，每個(gè)添加水平作5份平行測定，連續(xù)測定5d，計(jì)算方法回收率和精密度，結(jié)果見表1。

表1 血液中EtG的添加回收率和精密度(n=5)

2.4 案例應(yīng)用

對(duì)一中毒昏迷患者的血液，按本研究的方法檢測速可眠的含量，濃度為12.8μg/ml，超過中毒濃度，表明患者服用過量速可眠，說明該方法完全可以滿足臨床檢驗(yàn)中速可眠檢測的要求。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了測定人血液中速可眠的氣相色譜－質(zhì)譜方法，該方法樣品前處理簡單方便、靈敏度高、具有較好的回收率和精密度，分析成本低，為快速檢測血液樣品中的速可眠提供了一種可靠而有效的手段，在臨床檢驗(yàn)和法醫(yī)學(xué)鑒定等領(lǐng)域中具有重要意義。

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