診斷慢性粒細胞白血病的電化學生物傳感器的研究

劉文偉 張雪燕 習 靜 韓躍武

蘭州大學基礎醫學院生化教研所，甘肅蘭州 730000

診斷慢性粒細胞白血病的電化學生物傳感器的研究

劉文偉 張雪燕 習 靜 韓躍武

蘭州大學基礎醫學院生化教研所，甘肅蘭州 730000

目的 建立一種檢測慢性粒細胞白血病的方法。 方法 此實驗在已經篩選出慢性粒細胞白血病（CML）K562細胞5個特異性、結合率較高的核酸適體的基礎上，構建了一種檢測方法：采用兩種納米金屬材料分別標記5個適體，將標記后的10個適體，兩兩組合與CML K562同時結合，一個作為捕獲分子，一個作為測定分子與CML K562結合后，經氧化還原反應將測定分子上的金屬轉化成離子狀態，利用電化學工作站檢測對應的電流。 結果 篩選出了最佳組合（P2-S3-P1-S5）實現對CML K562的檢測，得到了檢測細胞數目與DPV電流值的擬合曲線方程。 結論 得到一種檢測下限可達到50個細胞的診斷慢性粒細胞白血病的電化學生物傳感器。

核酸適體；納米材料；CML K562；電化學生物傳感器

目前以適體作為識別元件的生物傳感器有光學適體生物傳感器、電化學生物傳感器、壓電石英晶體生物傳感器[1-4]。SELEX技術自問世已有20多年的發展歷程，光學適體生物傳感器和壓電石英晶體生物傳感器已相繼有商品，但適體電化學傳感器的研究還處于起步階段，其中早期診斷慢性粒細胞白血病（CML）的電化學生物傳感器也是一個空缺。筆者采用兩種納米材料分別標記5個適體，兩兩組合，一個作為捕獲分子，一個作為測定分子與CML K562結合后，經氧化還原反應將測定分子上的金屬轉化成離子狀態，利用電化學工作站檢測電流[5-10]，篩選出最佳組合，結合適體與CML K562的結合率，可以判斷結合的CML K562的數量，得到一種操作簡單、靈敏度高、快速的早期診斷慢性粒細胞白血病的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CHI1210A電化學分析儀（CHI公司，美國）、原子吸收分光光度計、德國耶拿原子吸收光譜儀，型號ZEEnit700。

質粒抽提、PCR等試劑盒、100 bp DNA marker、胎牛血清（上海生工生物技術有限公司）生物素-鏈霉親合素磁珠及磁力架、8種引物（上海生工生物技術有限公司）分別為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8：帶羧基磁性納米顆粒（平均粒徑為30 nm）（巴溪儀器有限公司）；四氯金酸溶液（HAuCl4，上海中秦化學試劑有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 用氨基標記核酸適體 S1、S2、S3、S4、S5

根據ssDNA適體的序列選擇各適體需要的上、下游引物經PCR擴增成5'端標記氨基和生物素的雙鏈DNA。用生物素-鏈霉親和素磁珠的方法分離，獲得5'端標記氨基適體[4]。

1.2.2 用巰基標記核酸適體 S1、S2、S3、S4、S5

根據ssDNA適體的序列選擇各適體上、下游引物經PCR擴增成5'端標記巰基和生物素的雙鏈DNA。用生物素-鏈霉親和素磁珠的方法分離，獲得5'端標記巰基適體。

1.2.3 在磁性納米粒子上固定標記氨基的核酸適體Ⅰ

將50 μL的帶羧基的磁性納米粒子用PBS緩沖溶液（pH=7.3）洗滌 5 次（500 μL/次）、5'端標記氨基的核酸適體40 μL，加入5 mg咪唑，超聲 30 min，室溫下放置 12 h。 利用磁鐵分離，分3次用600 μL PBS溶液洗滌沉淀，洗去過量的核酸適配體Ⅰ，將最終的沉淀（納米粒子上固定有核酸適體Ⅰ）分散在 500 μL PBS 緩沖溶液中，4℃冷藏[11]。

1.2.4 巰基標記核酸適體Ⅱ金膠探針的制備

1.2.4.1 金膠溶液的制備 參照文獻[2]制備金膠溶液：所用器皿均用王水浸泡過夜，用三蒸水沖洗。將HAuCl4配制成0.01%水溶液，將1.1 mg HAuCl4溶于11 mL三蒸水，過0.22 μm的濾膜。將檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O）配制成1%水溶液，將0.1 g檸檬酸三鈉溶于10 mL三蒸水，過0.22 μm的濾膜。取10 mL 0.01%HAuCl4煮沸，邊攪動邊準確加入250 μL的1%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。在沸騰狀態攪拌15～30 min。不加熱情況下再攪拌10 min。冷卻至室溫，用蒸餾水定容至原體積。置于棕色瓶內4℃保存，數月有效[12]。

1.2.4.2 巰基標記核酸適體Ⅱ金膠探針制備結合比例的確定用3 mL的金膠溶液溶解30、40、50 μL的巰基標記核酸適體Ⅱ，室溫靜置24 h，讓核酸適配體Ⅱ中的巰基與金膠充分結合，然后將此溶液在15 000 r/min條件下，離心25 min，分離后收集上清液。用500 μL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH=7.3）沖洗沉淀物3次，反復離心，收集上清液（除去過量的核酸適體），合并上清液，在260 nm處測定吸光度（圖1）。

由圖1可知，用40、50 μL含巰基的核酸適體與3 mL金膠溶液制備的金膠探針，在260 nm處有吸光度、用30 μL含巰基的核酸適體與3 mL金膠溶液制備的金膠探針，在260 nm處無明顯吸光度，說明40 μL以上比例的巰基標記核酸適體溶解于3 mL的金膠溶液制備金膠探針時，可確保巰基標記核酸適體Ⅱ過量。

1.2.4.3 巰基標記核酸適體Ⅱ金膠探針的制備 用3 mL的金膠溶液溶解40 μL的巰基標記核酸適體Ⅱ用上述方法制備金膠探針，將離心后的沉淀，加入500 μL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH=7.3）稀釋成一定濃度，4℃低溫冷藏。

1.2.5 CMLK562的特異性識別與分離

用含10%小牛血清的RPMI-1640的培養液，培養細胞。調整細胞計數濃度為5×105/mL左右，20 pmoL的納米粒子上固定有核酸適體Ⅰ懸浮液[9]，將 10 μL 的 PBS（1.5 mmol/L，pH=7.4）溶液和20 pmoL核酸適體Ⅱ的金膠探針置于自制的反應池中，加入20 μL的K562細胞溶液，在室溫下識別結合20 min。K562細胞與核酸適配體Ⅰ和Ⅱ特異性結合形成含有磁性顆粒和納米金的復合結構結構。然后，把電極放在一塊磁鐵上，將上述液體滴加在工作電極上，待三明治結構吸附在工作電極后，1～2 min，吸棄溶液，在磁場作用下，用PBS緩沖溶液沖洗幾次，分離沉淀，除去未結合的多余的適體或細胞液[14]。最后含復合結構的磁性顆粒吸附在電極表面待測定電流。

1.2.6 檢測電化學

1.2.6.1 兩種納米粒子標記的核酸適體兩兩組合后最佳配對的篩選 將吸有復合結構的磁性顆粒的電極放于磁鐵，將0.1 mol/L鹽酸溶液20 μL滴加在工作電極上，注意液滴覆蓋工作電極、參比電極和輔助電極。用+1.25 V恒電位預氧化150 s，使金膠探針中的金原子氧化成Au3+離子，立即進行反向陰極掃描，獲得Au3+電化學還原的差分脈沖伏安（DPSV）曲線[15]。從此圖可知金膠探針的特征電化學還原峰在+0.45 V（vs.Ag/AgCl），有兩組適體的配對產生的電流非常明顯，證明此組為最佳組合（P2-S3-P1-S5）。

1.2.6.2 適體檢測方法靈敏度及檢測限的測定 將篩選出的最佳組合的適體組（P2-S3-P1-S5），分別取20 pmoL按照上述實驗方法1.2.5和1.2.6，分別檢測不同數量的K562細胞。見圖2。

圖2以細胞數目為橫坐標，DPV電流值為縱坐標，利用SigmaPlot 10.0軟件做非線性回歸分析結果，擬合曲線方程為：Y=-0.205X/（62.73+X）， 其中 X 為細胞數目，Y 為 DPV電流值。如圖2所示，對慢性粒細胞白血病K562細胞的最低檢測限是50個細胞。隨著細胞數目的增加，DPV電流值增加，隨后待適體均被結合以后基本到達一個平臺，不再隨著細胞數目的增加而增加。對樣品重復測定10次，測得相對標準偏差RSD為3.78%。

2 結果

本文建立了一種用兩種金屬元素標記核酸適體，然后讓兩種標志物的核酸適體分別或兩兩組合后同時與靶物質慢性粒細胞白血病K562細胞結合分離后，分別測定金屬含量并比較前后變化，判斷出兩個核酸適體與靶物質結合的結合位點不同。然后用納米金為電化學活性物質，篩選出最佳組合（P2-S3-P1-S5），制備了早期診斷慢性粒細胞白血病的電化學生物傳感器。此種方法操作簡單，檢測靈敏度高，即使細胞數目為50個也能檢測出。

3 討論

慢性粒細胞白血病是一種影響血液及骨髓的惡性腫瘤。主要的診斷方法有血象、骨髓象、中性粒細胞堿性磷酸酶檢測（NAP）、細胞遺傳學檢測、分子遺傳學檢測等。然而，目前的分子診斷技術要求高，靈敏度不高，還無法在腫瘤發生的早期進行診斷，所以白血病的早期診斷是個亟待解決的問題。

隨著慢粒早期診斷研究的不斷深入，結合核酸適配子的特性，本實驗在研究了大量的核酸適體、核酸適體生物傳感器、核酸適體電化學生物傳感器相關報道的基礎上，結合本實驗室已經篩選出的5個結合率高于40%的慢性粒細胞白血病適體，利用核酸適體易于標記的特點，結和膠體金技術，磁性納米粒子兩種納米材料、電化學檢測技術，用帶羧基的磁性納米粒子的已經標記有氨基的5個ssDNA核酸適配子和膠體金標記了巰基的5個ssDNA核酸適配子兩兩組合的適體，一個作為捕獲分子，一個作為測定分子與CML K562結合后，利用磁鐵將結合物固定在三電極系統分別為：玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲網輔助電極的絲網印刷電極傳感器，經氧化還原反應將電極上的金原子轉化成離子狀態，利用電化學工作站檢測對應的電流，篩選出最佳組合。利用最佳組合適體對與不同數量的CML K562結合，通過檢測到的電流與CML K562的數量關系式，利用軟件做非線性回歸分析結果得到擬合曲線方程：Y=－0.205X/（62.73+X），其中X為細胞數目，Y為DPV電流值。對慢性粒細胞白血病K562細胞的最低檢測限可達到50個細胞。隨著細胞數目的增加，DPV電流值增加，隨后待適體均被結合以后基本到達一個平臺，不再隨著細胞數目的增加而增加。對樣品重復測定10次，測得相對標準偏差RSD為3.78%，從而得到一種操作簡單、靈敏度高、快速的早期診斷慢性粒細胞白血病的方法。

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Study of electrochemical biosensor for diagnosis chronic myeloid leukemia

LIU WenweiZHANG Xueyan XI JingHAN Yuewu
Research Institute of Biochemistry,School of Basic Medical Science,Lanzhou University,Gansu Province,Lanzhou 730000,China

Objective To creat a method of detection for chronic myelocytic leukemia.Methods A method of detection had been built,based on an experiment in lab,during which,5 highly-combined aptamers of CML K562 cells had been selected.Five aptamers were marked with two kinds of nanoparticles separately.The ten marked aptamers were divided into 20 pairs by every two combination.In every pair,the aptamers,one as the capture molecules,the other the determination molecules,were combined with CML K562 cells.Then the Au atoms were transformed into the state of Au-ion by REDOX reactions and electric current was sensed by electrochemical detection.Results The best pair of aptamers was selected to detecte CML K562,the fitted curve equation to test cells number and DPV of current value was obtained.Conclusion Get a electrochemical biosensor which can be used to diagnose CML K562 cells,with a detection limit up to 50 cells.

Aptamers;Nanoparticles;CML K562;Electrochemical biosensor

R557

A

1673-7210（2012）08（b）-0014-03

2012-03-14 本文編輯：張瑜杰）