microRNA-34a與非小細胞肺癌的關系及其可能調節機制

曾 婷 郝 麗 謝逸欣 馬 麗 舒文杰

1.廣州軍區疾病預防控制中心，廣東廣州 510507；2.解放軍軍事醫學科學院，北京 100080

microRNA-34a與非小細胞肺癌的關系及其可能調節機制

曾 婷1郝 麗1謝逸欣1馬 麗1舒文杰2

1.廣州軍區疾病預防控制中心，廣東廣州 510507；2.解放軍軍事醫學科學院，北京 100080

目的 探討miRNA-34a在非小細胞肺癌發生中的作用及其可能機制。方法 選取56例經病理診斷確診為非小細胞肺癌患者的癌組織及癌旁組織，RT-PCR法測定miRNA-34a及c-myc mRNA的表達水平，免疫組織化學法檢測癌組織及癌旁組織的P53蛋白及c-myc蛋白的表達水平。 結果 癌組織的miRNA-34a的表達水平低于癌旁組織，c-myc mRNA表達及c-myc、P53蛋白表達陽性率高于癌旁組織（P＜0.05）。miRNA-34a與c-myc mRNA表達水平呈負相關關系（P＜0.05）。 結論miRNA-34a對非小細胞肺癌的發生具有一定的調節作用，可能是非小細胞肺癌發生的重要環節，miRNA-34a主要是通過與c-myc的結合而發揮其調節作用。

miRNA-34a；c-myc；P53；非小細胞肺癌

肺癌是嚴重威脅人類生命的惡性腫瘤之一，具有病死率高、預后兇險的特點。根據組織類型肺癌可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC） 和非小細胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）兩種[1]，其中，非小細胞肺癌占肺癌總數的80%以上，是肺癌的主要組織類型[2]；非小細胞肺癌患者術后5年生存率不足15%[3]。miRNA是一種長18～24堿基高度保守的單鏈非編碼RNA，它通過與目的RNA的結合從而影響特定基因的蛋白表達[4]，在人體內miRNA類似抑癌基因或致癌基因參與了多種腫瘤的發生發展過程。miRNA-34a是miRNA家族的重要成員之一，其目的RNA為c-myc，miRNA-34a通過與c-myc轉錄生成的編碼RNA結合發揮其抑制腫瘤發生的作用[5]。有研究證實，miRNA-34a對c-myc RNA的調控作用受P53蛋白的調節[6]。本次研究通過對56例非小細胞肺癌患者癌灶及其癌旁組織miRNA-34a、P53蛋白及c-myc蛋白關系的研究，擬探知三者是否在非小細胞肺癌的發生過程中存在類似作用，以期為更好的了解非小細胞肺癌的發生機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011年8月～2012年2月在解放軍廣州軍區總醫院腫瘤科住院，診斷為原發性非小細胞肺癌的56例患者為研究對象，男41例，女15例，平均年齡（57.0±6.5）歲；患者肺癌類型均經兩家三甲醫院病理科確診一致，其中，鱗癌38例，腺癌18例；所有患者均否認術前接受放療及化療；肺癌的臨床分期參考國際抗癌聯盟2009版非小細胞肺癌分期標準，Ⅰ期20例，Ⅱ期18例，Ⅲ期18例，其中有22例發生淋巴結轉移。術中留取切除的新鮮癌組織標本及癌旁組織標本，經生理鹽水沖洗表面血漬后立即放入液氮罐中保存。

1.2 RNA的提取及RT-PCR法

取50 mg組織標本，加入300 μL生理鹽水，勻漿器勻漿后Trizol法提取總RNA（試劑盒購自Invirtogen），并通過異丙醇沉淀法濃縮提取的RNA，提取結束后采用生物分光光度計測定其純度和濃度。采用TAKARA公司生產的Primer-ScriT reagent（DRR037A）進行逆轉錄生成 cDNA。U6 小核核糖核酸作為內參。采用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System （Foster City，CA）繪制溶解曲線，進行miRNA-34a及c-myc mRNA的相對定量。

1.3 免疫組化法

采用鼠抗人P53單克隆抗體（購自Santa Cruz公司），應用免疫組織化學SP法進行染色，染色過程中注意控制染色時間及溫度，染色時以PBS溶液代替一抗進行平行對照。P53蛋白主要在細胞核表達，胞核中出現棕褐色顆粒說明染色陽性。計算陽性染色率時在10個高倍鏡視野中隨機選取3個進行陽性率判定，最后取其均值作為P53蛋白表達陽性率的代表，若陽性率高于30%則定義為陽性。c-myc蛋白的免疫組織化學檢測原理及方法同P53蛋白（一抗為鼠抗人單克隆抗體）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，癌組織及癌旁組織miRNA-34a及c-myc mRNA表達水平比較采用配對t檢驗；計數資料用率表示，肺癌組織及癌旁組織P53、c-myc蛋白表達陽性率比較采用χ2檢驗；miRNA34-a表達水平與P53、c-myc蛋白表達相關性分析采用Spearman秩相關。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌組織及癌旁組織的miRNA-34a和c-myc mRNA表達水平比較

肺癌組織miRNA-34a的相對表達量為 （1.18±0.25），癌旁組織為（1.67±0.31）；癌組織 c-myc mRNA 表達量為（0.39±0.12），癌旁組織為（0.16±0.09）。 非小細胞肺癌組織miRNA-34a及c-myc mRNA的相對表達量高于癌旁組織，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖1。由圖2可知，miRNA34-a與c-myc mRNA表達呈負相關關系，隨著miRNA34-a表達量的增加c-myc mRNA表達水平下降（r=-0.80，P＜0.05）。

2.2 肺癌組織及癌旁組織的P53、c-myc蛋白表達水平比較

采用免疫組織化學法染色后，發現在56例肺癌組織標本中有29例P53蛋白呈陽性表達，占51.79%，在癌旁組織中有4例呈陽性表達，表達率為7.14%；不同組織類型P53蛋白的陽性表達率差異有高度統計學意義（P<0.01），見表1，圖3。癌組織標本中c-myc蛋白陽性表達33例，占58.9%，癌旁組織中陽性表達2例，占3.6%，不同組織類型c-myc蛋白的陽性表達率差異有高度統計學意義（P<0.01），見表1、圖3。

表1 不同組織類型P53蛋白及c-myc蛋白表達情況（例）

2.3 miRNA-34a及c-myc mRNA與P53、c-myc蛋白表達的關系

在P53蛋白表達判定為陽性的癌組織和癌旁組織中，miRNA-34a 的表 達 水平 為 （1.09±0.25），c-myc mRNA 為（0.45±0.11）；在判定為陰性的癌組織及癌旁組織中miRNA-34a 的表達水平為（1.54±0.32），c-myc mRNA 為（0.20±0.11）。見圖4。c-myc蛋白表達陽性的肺癌及癌旁組織中miRNA-34a 的表達水平為（1.17±0.25），c-myc mRNA 為（0.43±0.12），在判定為陰性的癌組織及癌旁組織中miRNA-34a的表達水平為（1.48±0.36），c-myc mRNA 為（0.23±0.13），見圖 5。

3 討論

現代醫學理論認為，癌癥的發生是多因素參與、基因與環境交互作用導致的一種細胞凋亡異常狀態。以往對于肺癌遺傳易感性的研究多集中在DNA水平，如SNP突變[7]（cyp1a1 m1 位點的 T-C 突變）、基因缺失[8]（GSTT、GSTM 缺失）以及特定基因的甲基化狀態（CDH13、p16基因）[9-10]。但是單純的DNA水平的研究并不能解釋完全解釋肺癌的遺傳易感性。近年來有研究發現，非編碼RNA在癌癥的發生過程中起到了致癌或抑癌基因的作用，miRNA的作用機制主要是與靶基因的目的mRNA結合從而影響目的基因的轉錄及翻譯水平。miRNA-34a是miRNA-34家族的主要成員之一，miRNA-34a在人體內的目的mRNA為cymc，c-myc蛋白在人體內主要作用是促進細胞進入S期完成DNA的合成復制。c-myc的過度表達被認為是腫瘤發生的強烈信號。miRNA-34a通過與c-myc的結合降低c-myc蛋白的表達水平，從而發揮其抑制腫瘤發生的作用。

本次研究發現，癌組織miRNA-34a的表達水平低于癌旁組織，c-myc mRNA水平高于癌旁組織；miRNA-34a與cmyc mRNA呈負相關關系，一定程度的證實了c-myc mRNA為miRNA-34a的靶向基因。免疫組織化學發現，c-myc蛋白表達水平較低的癌旁組織其c-myc轉錄水平也較低。研究還發現，癌組織中的P53蛋白表達水平高于癌旁組織。P53蛋白陽性組織的miRNA-34a的水平要低于P53蛋白表達陰性者。這與以往研究發現的P53蛋白對miRNA-34a具有調節作用相一致，但是作用方向卻相反，這可能是由于以往研究發現的是P53調節蛋白而不是組織中的P53蛋白對所miRNA-34a起的作用。另外，本次調查對P53蛋白的測定采用免疫組織化學法，而非以往研究的western blot法，且以往的研究是細胞培養發現的結果，而本次研究直接取材于癌組織，具有一定的局限性。

總之，本次研究發現miRNA-34a對肺癌的發生具有一定的調節作用，可能是肺癌發生的重要環節，miRNA-34a主要是通過與c-myc的結合而發揮其調節作用。

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The relationship between microRNA-34a and non small-cell lung cancer and its possible regulation mechanism

ZENG Ting1HAO Li1XIE Yixin1MA Li1SHU Wenjie2
1.Center for Disease Control and Prevention in Guangzhou Military Region,Guangdong Province,Guangzhou 510507,China;2.Academy of Military Sciences,Beijing 100080,China

Objective To explore the effect of miRNA-34a on the occurrence of small cell lung cancer(SCLC)and its possible mechanism.Methods Lung cancer tissues and its corresponding non cancer tissues in 56 cases of patients who diagnosed as SCLC by pathology were collected for detecting its miRNA and c-myc mRNA expression by RT-PCR.Immunohistochemistry method was used for detecting P53 and c-myc protein expression in cancer tissue and its corresponding non cancer tissues.Results Compared with corresponding non-cancer tissues,the expression of miRNA-34a in lung cancer tissuewaslower,howevertheexpressionofc-mycmRNA,c-mycproteinandP53proteinwerehigher(P＜0.05).There was a negative correlation between miRNA-34a and c-myc mRNA expression level(P＜0.05).Conclusion miRNA-34a plays a regulating role on the occurrence of SCLC,and it may be an important factor on SCLC occurrence by combination with c-myc.

miRNA-34a;c-myc;P53;SCLC

R734.2

A

1673-7210（2012）08（b）-0005-03

國家自然科學基金青年科學基金項目（30700139）。

2012-05-14 本文編輯：程 銘）