他克莫司對多發性硬化大鼠髓鞘堿性蛋白的動態變化及影響

趙麗波 張健莉 付宏娟 黃月萍

黑龍江省醫院老年神經內科，黑龍江哈爾濱 150036

他克莫司對多發性硬化大鼠髓鞘堿性蛋白的動態變化及影響

趙麗波 張健莉 付宏娟 黃月萍

黑龍江省醫院老年神經內科，黑龍江哈爾濱 150036

目的 探討他克莫司（FK506）對多發性硬化（MS）大鼠髓鞘堿性蛋白檢測的動態變化及影響。 方法 將試驗動物隨機分為兩組，對照組（10只）予以實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）+生理鹽水組；研究組（12只）在EAE誘導的第1～7天，每日腹腔內注射劑量為1mg/kg的FK506，其中急性發作期8只，緩解期4只。檢測研究組和對照組周圍血和腦脊液髓鞘堿性蛋白（MBP）的水平，并動態觀察應用他克莫司治療前及治療后不同時間MBP的變化情況。結果 研究組血清和腦脊液中的MBP水平均顯著高于對照組（P＜0.05）。且兩組腦脊液中的MBP水平均顯著高于血清中MBP水平（P＜0.05）。研究組大鼠急性發作期及緩解期血清及腦脊液中MBP水平分別明顯高于對照組（P＜0.01），且大鼠急性發作期MBP水平血清及腦脊液中均分別顯著高于MS緩解期（P＜0.01）。且大鼠腦脊液MBP和血清MBP水平呈正相關（r=0.562，P＜0.01）。12只大鼠予以他克莫司腹腔注射后，治療后的第3天及治療后第7天血清和腦脊液MBP水平均較治療前明顯降低，且腦脊液MBP水平較血清MBP水平降低更明顯（P＜0.01）。 結論 通過檢測周圍血和MBP的水平，并動態觀察應用他克莫司治療前及治療后MBP的變化情況，一方面對判斷MS預后、病情嚴重程度和臨床診斷具有重要的臨床意義，另一方面可能為預防多發性硬化的臨床復發提供一種有效的新藥提供指導依據。

多發性硬化；髓鞘堿性蛋白；血液；腦脊液；大鼠

多發性硬化（mulitple sclerosis，MS）是一種以中樞神經系統白質脫髓鞘為主要病理特點的自身免疫性疾病，MS產生的免疫反應多認為是自身免疫細胞被激活后對髓鞘堿性蛋白（MBP）的免疫反應[1]。MBP是構成中樞神經系統髓鞘的一種特殊蛋白質，在髓鞘形成和腦分化發育過程中起著重要作用[2]。MS患者體內中樞神經系統的自身抗原-MBP暴露與免疫活性細胞相互作用誘導了特異的免疫應答，導致炎性髓鞘病理性脫失，游離的MBP就會進入血液中導致血液中含量升高[3]。目前臨床對MS進行腦脊液免疫學檢查項目較多，但尚無一滿意的特異性檢查，因此，臨床一般將周圍血和腦脊液同時進行檢查[4]。他克莫司（FK506）是一種免疫抑制劑，除了在抑制器官移植排斥反應方面具有顯著療效外，還廣泛應用于斑禿、銀屑病、魚鱗病、糖尿病、白塞病、變應性皮炎、類風濕性關節炎以及多發性硬化病等自身免疫疾病的治療，在對脊髓損傷的模型中具有保護神經，營養神經和促進神經再生和抑制T細胞增生、活化的作用。本研究旨在通過觀察利用髓鞘堿性蛋白作為抗原，復制MS的動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）豚鼠周圍血和腦脊液MBP的水平，并動態觀察應用他克莫司治療前及治療后不同時間MBP的變化情況，從而可能為預防MS的臨床復發提供一種有效的新藥提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及方法

豚鼠22只，雌雄各半，7～8周齡，體重 200 g左右，利用髓鞘堿性蛋白作為抗原，復制MS的動物模型EAE，在每只大鼠的雙側后足跖一次性皮下注射含有豚鼠MBP 25μg的弗氏完全佐劑（FCA）200μL，模型制備成功的表現為急性、嚴重的單向病程，可自發緩解。將試驗動物隨機分為兩組，對照組予以EAE+生理鹽水，共10只，研究組在EAE誘導的第1～7天，每日腹腔內注射劑量為1mg/kg的FK506，共12只，其中急性發作期8只，緩解期4只。

1.2 統計學方法

數據采用SPSS 13.0進行統計學處理，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗或進行方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠及對照組血清和腦脊液中MBP水平比較

研究組大鼠血清和腦脊液中的MBP水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。且兩組腦脊液中的MBP水平均顯著高于血清中MBP水平，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表 1。

表1 兩組大鼠血清和腦脊液中MBP水平比較（，ng/m L）

表1 兩組大鼠血清和腦脊液中MBP水平比較（，ng/m L）

注：與同組血清MBP比較，#P＜0.05

組別 只數 MBP水平血清 腦脊液研究組對照組12 10 t值 P值7.62±1.74 1.52±0.83 3.946＜0.01 12.07±3.42#4.39±1.35#5.284＜0.01

2.2 大鼠急性發作期及緩解期MBP在血清及腦脊液中的變化情況比較

研究組MS大鼠急性發作期及緩解期血清及腦脊液中MBP水平分別明顯高于對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01），且MS急性發作期MBP水平血清及腦脊液中均分別顯著高于MS緩解期，差異有高度統計學意義（P＜0.01），且MS大鼠其腦脊液MBP和血清MBP水平呈正相關 （r=0.562，P ＜ 0.01）。 見表 2。

2.3 研究組大鼠血清和腦脊液治療前后不同時間MBP水平的變化情況比較

12只大鼠予以他克莫司注射后，結果顯示，治療后的第3天及治療后第7天血清和腦脊液MBP水平均較治療前明顯降低（P＜0.01），且腦脊液MBP水平較血清MBP水平降低更明顯，差異有統計學意義（P＜0.01），見表3。

3 討論

MS是一種中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病，其病因及病理學機制至今仍未完全闡明，但MS自身免疫的發病機制已得到證實和公認[5]。各種原因導致髓鞘破壞后，血清或腦脊液中的MBP濃度增高，因此測定血清和腦脊液MBP的水平，可以用于反映中樞神經系統有無實質性損害及有無髓鞘脫失[6]。由于MS患者的免疫功能異常，使MBP具有抗原性，引起T淋巴細胞致敏活化，而致敏的T淋巴細胞反應對髓鞘有很大的破壞作用[7]。

表2 大鼠急性發作期及緩解期MBP在血清及腦脊液中的變化情況比較（，ng/m L）

表2 大鼠急性發作期及緩解期MBP在血清及腦脊液中的變化情況比較（，ng/m L）

注：與緩解期比較，*P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.01

組別 只數 MBP水平血清 腦脊液急性發作期緩解期對照組F值P值8 4 1 0 10.86±1.59*△5.35±1.14△1.52±0.83 5.342＜0.01 17.45±2.82*△8.23±1.44△4.39±1.35 7.231＜0.01

表3 研究組大鼠血清和腦脊液治療前及治療后的不同時間MBP 的變化情況比較（，ng/m L，n=32）

表3 研究組大鼠血清和腦脊液治療前及治療后的不同時間MBP 的變化情況比較（，ng/m L，n=32）

指標 治療前 治療后第3天治療后第7天 F值 P值血清MBP水平腦脊液MBP水平t值P值8.29±1.31 12.07±3.42 3.389＜0.01 7.62±1.74 5.84±1.85 3.971＜0.01 3.89±0.42 1.67±0.23 0.428＜0.01 8.253 9.527＜0.01＜0.01

本組資料顯示，研究組大鼠血清和腦脊液中的MBP水平均顯著高于對照組（P＜0.05），提示檢測MBP含量變化是診斷MS的一項有價值的生化指標，本組表2結果顯示，研究組急性發作期及緩解期大鼠血清及腦脊液中MBP水平分別明顯高于對照組（P＜0.01），說明大鼠活動期血清MBP明顯升高，反映了損害的范圍和嚴重程度，尤其對判斷MS是否處于活動期具有重要的臨床意義[8]。

本組表1、2均顯示，研究組12只大鼠，其中急性發作期8只MS其腦脊液中MBP水平最高。Majewska等[9-10]研究證實，MS患者急性期腦脊液MBP與臨床評分關系密切，提出監測腦脊液MBP的變化水平，有利于判斷MS的病情嚴重程度和預后。且大鼠腦脊液MBP和血清MBP水平呈正相關（r=0.562，P＜0.01），說明作為主要自身抗原之一的MBP對MS的發病敏感性高，檢測患者CSF和血清中的MBP水平對于MS的診斷和療效監測有重要參考價值。

FK506是一種新型免疫抑制劑，是一種廣泛應用于器官移植的大環內酯類免疫抑制藥物，于1984年從日本筑波山土壤中被分離到。研究組12只大鼠應用他克莫司治療后，MBP水平在治療前明顯增加，但治療后的第3天及治療后的第7天的不同時間顯著下降，說明MS對他克莫司等激索類藥物的短程療效較好。國內外已有學者將FK506應用于自身免疫性疾病的研究，其中，Gold等[11]研究證實，FK506通過免疫抑制和神經保護作用顯著改善小鼠的髓鞘脫失和軸突損傷。

綜上所述，通過檢測周圍血和腦脊液髓鞘堿性蛋白的水平，并動態觀察應用他克莫司治療前及治療后MBP的變化情況，一方面對判斷MS預后、病情嚴重程度和臨床診斷具有重要的臨床意義，另一方面可能為預防多發性硬化的臨床復發提供一種有效的新藥提供指導依據，但由于樣本量過小，仍需日后在擴大樣本量的基礎上對其進一步深入研究。

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Influence of FK 506 on dynam ic change of m yelin basic protein in rats with multiple sclerosis

ZHAO Libo ZHANG Jianli FU Hongjuan HUANG Yueping
Department of Old Age Neurology,Heilongjiang Province Hospital,Heilongjiang Province,Harbin 150036,China

Objective To explore the impact of the dynamic changes of tacrolimus formultiple sclerosis ratmyelin basic protein detection.MethodsExperimental animalswere randomly divided into two groups,the control group were given the EAE+saline group,a total 10,study group in EAE induced daily intraperitoneal injection dose for 1mg/kg FK506 from 1 to 7 days,a total of 12 acute exacerbation of 8 rats,4 rats in remission.We examined the level of the blood and cerebrospinal fluidmyelin basic protein(MBP)and dynamic observation for12 casesMSrats(study group)and 10 normalhealthy subjects(control group).ResultsMBP(research group)in serum and cerebrospinal fluid were significantly higher than that of the normal control group(P<0.05).And MBP in the cerebrospinal fluid of two groupswere significantly higher than the serum MBP level(P<0.05).The serum and CSFMBP level of acute exacerbation and remission period of MS rats in the research group were significantly higher than that in the control group (P<0.01),and MBP in serum and cerebrospinal fluid of acute exacerbation MSwere respectively significantly higher than MS rats in remission (P<0.01).In addition to the conventional basis for symptomatic 12 MS rates after admission tacrolimus treatment,after treatment 3 days and 7days,MBP level in the serum and CSF was significantly lower than before treatment,compared with serum，MBP levels in the cerebrospinal significantly decreased (P<0.01).ConclusionDynamic observation MBP the change by detecting the level of peripheral blood and MBP and the application of tacrolimus the secretary before treatmentand after treatment on the one hand,to judge MSprognosis,the severity of the disease and the clinical diagnosis has importantthe clinical significance,on the other hand,itmay be an effective new drug for the prevention ofmultiple sclerosis clinical recurrence provide the basis for guiding.

Multiple sclerosis;Myelin basic protein;Blood;Cerebrospinal fluid;Rats

R744.5

A

1673-7210（2012）12（a）-0016-03

黑龍江省科技計劃項目（課題編號：GC12C305-1）。

2012-09-17 本文編輯：馮 婕）