生脈飲對TNF-α誘導的大鼠心肌成纖維細胞膠原合成的影響

王敬春 徐 波 張 春

1.齊齊哈爾醫學院藥學系，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾衛生學校藥學教研室，黑龍江齊齊哈爾 161005

生脈飲對TNF-α誘導的大鼠心肌成纖維細胞膠原合成的影響

王敬春1徐 波2張 春1

1.齊齊哈爾醫學院藥學系，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾衛生學校藥學教研室，黑龍江齊齊哈爾 161005

目的 探討生脈飲對腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factorα，TNF-α）誘導的新生大鼠心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）膠原合成的影響及其機制。 方法 用不同濃度生脈飲載藥血清與TNF-α處理體外培養的CFs，采用分光光度法檢測細胞培養上清液中羥脯氨酸含量，采用實時定量RT-PCR檢測MMP1和TIMP1mRNA的表達水平。 結果TNF-α處理組羥脯氨酸含量較空白對照組明顯升高；與TNF-α組比較，生脈飲口服液血清中羥脯氨酸含量降低。與空白對照組比較，TNF-α組MMP1和TIMP1mRNA表達上調；生脈飲載藥血清組MMP1較TNF-α組顯著升高，而TIPM1顯著降低，差異有統計學意義（均P<0.05），并呈濃度依賴性。 結論 生脈飲對TNF-α誘導的CFs膠原合成具有抑制作用，下調MMP1和上調TIPM1mRNA表達可能是其作用的機制之一。

心肌纖維化；生脈飲；腫瘤壞死因子；膠原合成

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是指在正常心肌組織中膠原纖維過量積聚或膠原成分發生改變，阻止或逆轉纖維化是延緩心力衰竭、減少心律失常發生的重要手段[1]。MF受多種因素調控，其中膠原代謝調節酶基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）和基質金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor ofmetalloproteinases，TIMPs）的平衡失調引起的膠原合成增加、降解減少是主要的因素[2]。心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）在MF的發生發展過程中起重要作用，MF時CFs增殖并分泌大量膠原蛋白[3]。根據MF特性，中醫學可將心肌間質纖維化歸屬于“心痹”范疇，病情發展可逐步導致“心悸”、“喘證”、“水腫”等[4]。目前現代醫學對MF沒有確切的治療手段，中醫藥干預能從多環節、多靶點發揮作用，具有一定的優勢[5]。生脈飲是中醫益氣養陰、益心復脈的著名古方，出自金元時期張元素所著的《醫學啟源》。本實驗旨在探討生脈飲對TNF-α誘導的CFs膠原合成的影響及其機制，為臨床用藥提供可靠依據。

1 儀器與試藥

1.1 實驗動物

新生1～3 d Wistar大鼠由齊齊哈爾醫學院實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑

生脈飲購自北京同仁堂科技發展股份有限公司（國藥準字：Z11020363）；精制胎牛血清購自江海生物高新技術開發有限責任公司；DMEM培養基購自Gibco公司；TNF-α購自北京白鷺園生物技術有限公司；Trizol RNA提取試劑購自美國 Invitrogen公司；Prime Script RT reagent Kit逆轉錄與SYBR Premix Ex Taq TMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司。參照GenBank數據庫，采用Primer primer 5.0計算機軟件設計引物，由Takara公司合成。基因序列如下：MMP1（擴增片段長度 100 bp），Forward Primer為 5′-TTC AGC CAG GCC CAG GTA-3′，Reverse Primer為 5′-TGA GCA GCC ACA CGA TAC AAG T-3′；TIMP1 （擴增片段長度 82 bp），Forward Primer為5′-GAG AAG GGC TAC CAG AGC GA-3′，Reverse Primer為5′-TCG AGA CCCCAA GGTATTGC-3′；GAPDH（擴增片段長度 134 bp），Forward Primer為 5′-TGG TCTACA TGTTCCAGT ATG ACT-3′，Reverse Primer為 5′-CCA TTT GAT GTT AGC GGG ATC TC-3′。羥脯氨酸試劑盒購自南京建成生物公司。

1.3 儀器

2700 型PCR System擴增儀為Applied Biosystems公司產品，ABI 7300熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品，UV-2550型紫外分光光度計為日本島津產品。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 載藥血清的制備 取SD大鼠，隨機分為兩組，即空白對照組及生脈飲組，每組5只。上述兩組大鼠依次分別按生理鹽水 2mL/只和生脈飲 3mL/（kg·d）灌服（相當于正常人臨床劑量的6倍）。每日1次，連續7 d。于第7天上午末次灌服后2 h腹主動脈取血。4℃離心取上清，同組血清混合，56℃水浴滅活 30min，-20℃凍存。

2.1.2 CFs分離和培養 無菌條件下開胸取出仔鼠心臟，PBS漂洗，剪成約1mm3碎塊。加入0.25%胰蛋白酶于37℃消化10 min，用含20%胎牛血清的DMEM終止消化，加Hanks液離心收集細胞。所得細胞用培養液懸浮，分種于25 cm2塑料培養瓶中，根據CFs貼壁速度快的原理，采用差速貼壁法5%CO2培養箱內培養90min，棄上清液，貼壁細胞即CFs。待CFs生長接近融合時傳代，實驗采用3～5代細胞。

2.1.3 實驗分組及處理 實驗分空白對照組、TNF-α組、TNF-α+空白血清組、TNF-α+5%載藥血清組、TNF-α+10%載藥血清組、TNF-α+20%載藥血清組。細胞經0.125%胰蛋白酶消化后接種于多聚賴氨酸包被的96孔板上，接種密度為1×105細胞/mL，培養24 h后換無血清培養液同步馴化24 h。空白對照組給予等體積培養基，TNF-α組給予50 ng/mL TNF-α，TNF-α+空白血清組給予含空白對照大鼠血清的DMEM添加50 ng/mL TNF-α，各濃度的生脈飲+TNF-α處理組分別給予含5%、10%或20%的生脈飲載藥血清的DMEM同時添加TNF-α50 ng/mL。共孵育24 h后，收集細胞。

2.1.4 羥脯氨酸測定 將CFs以4×104細胞/mL的濃度接種于6孔板中。藥物處理24 h后，收集各組細胞上清液，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。上清液羥脯氨酸含量（mg/L）=（測定管吸光度值-空白管吸光度值）/（標準管吸光度值-上空白管吸光度值）×標準管濃度。

2.1.5 實時定量PCR檢測 實時定量PCR檢測CFs MMP1和TIMP1mRNA表達。用Trizol試劑抽提細胞總RNA，取2μg RNA逆轉錄合成cDNA。Real-time PCR反應體系擴增條件為：95℃ 10 s，然后 95℃ 5 s，60℃ 31 s，進行 40 個循環。數據采用 2-ΔΔCt相對定量法分析。

2.1.6 統計學方法 采用統計軟件SPSS 11.5對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析，組間差異用SNK-q檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2.2 結果

2.2.1 羥脯氨酸測定 羥脯氨酸含量測定結果顯示，空白對照組CFs培養上清液中羥脯氨酸含量較低，經50 ng/mLTNF-α刺激24 h后，羥脯氨酸含量較空白對照組明顯升高（P＜0.05），表明TNF-α具有促進膠原蛋白合成作用。經過各濃度的生脈飲載藥血清處理，CFs培養上清中羥脯氨酸含量較TNF-α組明顯減少，并呈濃度依賴性（均P<0.05）。見表1。

表1 生脈飲載藥血清對TNF-α誘導的CFs羥脯氨酸含量的影響（，n=6）

表1 生脈飲載藥血清對TNF-α誘導的CFs羥脯氨酸含量的影響（，n=6）

注：與 TNF-α組比較，*P<0.05

組別 羥脯氨酸（μg/mL）空白對照組TNF-α組TNF-α+空白血清組TNF-α+5%載藥血清組TNF-α+10%載藥血清組TNF-α+20%載藥血清組0.92±0.14*2.73±0.28 2.67±0.29 1.97±0.27*1.79±0.22*1.55±0.19*

2.2.2 生脈飲載藥血清對CFs MMP1 mRNA表達的影響 MMP1 mRNA在空白對照組CFs中呈低表達，經50 ng/mL TNF-α刺激24 h后，MMP1表達代償性增加，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。同時，經過3個濃度生脈飲載藥血清處理后，CFs TIMP1 mRNA表達較TNF-α組明顯升高，呈濃度依賴性（均P<0.05）。見表2。

表2 生脈飲載藥血清對TNF-α誘導的CFs MMP1和TIMP1基因表達的影響（，2－ΔΔCt，n=5）

表2 生脈飲載藥血清對TNF-α誘導的CFs MMP1和TIMP1基因表達的影響（，2－ΔΔCt，n=5）

注：與 TNF-α組比較，*P<0.05

組別 MMP1 mRNA表達 TIMP1mRNA表達空白對照組TNF-α組TNF-α+空白血清組TNF-α+5%載藥血清組TNF-α+10%載藥血清組TNF-α+20%載藥血清組1.05±0.18*2.32±0.25 2.46±0.32 4.20±0.44*4.64±0.37*5.88±0.49*1.02±0.27*3.90±0.42 4.10±0.26 3.40±0.29*2.90±0.33*2.60±0.28*

2.2.3 生脈飲對CFs TIMP1 mRNA表達的影響 TIMP1 mRNA在空白對照組CFs中呈低表達，經50 ng/mL TNF-α刺激24 h后，TIMP1mRNA表達上調，與空白對照組比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。3種濃度的生脈飲載藥血清處理后，CFs TIMP1 mRNA表達較TNF-α組明顯降低，呈濃度依賴性（均P<0.05）。

3 討論

“生脈飲”由人參、麥冬和五味子3藥組成。人參甘溫不燥，具有補氣生津的作用為君藥；麥冬甘寒生津，潤肺養陰，與人參相協氣陰雙補，相得益彰為臣藥；五味子酸濕收斂，益氣生津，斂陰止汗，既可固氣津之外泄，又能復氣陰之損耗，與人參、麥冬相輔相成為佐藥。現代研究發現，人參含有多種人參皂苷，能促進造血功能，提高應激反應能力[6]。麥冬含有多種甾體皂苷，能提高免疫力，抗心率失常和擴張外周血管作用[7]。五味子主含揮發油等，與人參相似的適應原樣作用，能增強機體對非特異性刺激的防御能力[8]。本實驗結果發現，生脈飲載藥血清使CFs培養上清羥脯氨酸表達量明顯減少，提示在MF形成過程中，生脈飲可通過抑制膠原含量而逆轉MF。

MF主要的特征為成纖維細胞數目增多和心肌間質膠原過度沉積，導致心肌順應性下降，心臟舒縮及電傳導功能障礙，是引起心力衰竭的重要原因[9]。有研究發現，TNF-α通過與心肌細胞和成纖維細胞表面受體結合，誘導心肌細胞凋亡及引起細胞外膠原纖維累積，并且激活MMPs，最終也導致心室纖維化、擴張及泵功能衰竭。抗TNF-α治療能阻止轉基因鼠心肌膠原合成、沉積和變性。心肌過量產生的TNF-α可以引起MF、心力衰竭[10]。本研究發現，結果顯示TNF-α可以促進膠原蛋白合成，誘導MMP1酶降解，增加異常膠原合成，還能夠抑制TIMP1表達，增加MMP1酶活性，表明TNF-α誘導下的CFs模擬了MF的過程，而生脈飲能逆轉TNF-α誘導的CFs膠原蛋白合成增加。

MMP降解細胞外基質成分。MMP-1是最先完成蛋白純化和cDNA克隆的脊椎動物膠原酶，以酶原形式合成，通過蛋白水解作用裂解酶原N-端殘基，與其他MMP分享一個催化區及一個序列相似于血紅素蛋白的羧端。在正常成人組織中MMP-1表達量極少，但在病理情況下如創傷愈合、修復或重塑過程中，MMP-1表達量增加[11]。MMP和TIMP處于平衡狀態，有助于保持動脈壁內細胞外基質成分合成與降解相互平衡達到穩定作用[12]。正常心臟膠原合成是一個動態的過程，合成增加和（或）降解減弱均導致膠原累積。本研究發現與空白對照組比較，TNF-α組CFs中TIMP1 mRNA表達顯著升高（P<0.05），促使膠原纖維增生，同時MMP-1 mRNA也代償性升高。與TNF-α組相比較，3個濃度生脈飲載藥血清處理使CFs中MMP-1mRNA表達升高 （P<0.05），而TIMP1 mRNA表達降低。可見生脈飲可能是通過下調MMP-1和上調TIMP1 mRNA表達水平，從而抑制心肌膠原纖維增生及心肌間質纖維化，這可能是其防治心肌纖維化的的作用機制之一。

[1]Lee DW，Lee TK，Cho IS，et al.Creation ofmyocardial fibrosis by transplantation of fibroblasts primed with survival factors [J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2011，301（3）：1004-1014.

[2]Truter SL，Catanzaro DF，Supino PG，et al.Differential expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors and extracellular matrix remodeling in aortic regurgitant hearts [J].Cardiology，2009，113（3）：161-168.

[3]Castoldi G，Digioia CR，Bombardi C，et al.MiR-133a regulates collagen 1A1：potential role ofmiR-133 a in myocardial fibrosis in angiotensinⅡ-dependent hypertension[J].JCell Physiol，2012，227（2）：850-856.

[4]樓洪剛，何俏軍，吳洪海，等.雞肝散總黃酮抗胸痹證的實驗研究[J].中藥材，2003，26（12）：878-881.

[5]金鋒，儲全根，李敏.從“瘀”論治糖尿病心肌病[J].安徽中醫學院學報，2011，31（1）：6-8.

[6]Lee B，Shim I，Lee H，et al.Effect of ginsenoside Re on depression-and anxiety-like behaviors and cognition memory deficit induced by repeated immobilization in rats[J].JMicrobiolBiotechnol，2012，22（5）：708-720.

[7]Xu M，Wang G，Xie H，et al.Pharmacokinetic comparisons of schizandrin after oral administration of schizandrin monomer，Fructus Schisandrae aqueous extract and Sheng-Mai-San to rats[J].JEthnopharmacol，2008，115（3）：483-488.

[8]Kwon DY，Kimda S，Yang HJ，et al.The lignan-rich fractions of Fructus Schisandrae improve insulin sensitivity via the PPAR-γpathways in in vitro and in vivo studies[J].JEthnopharmacol，2011，135（2）：455-462.

[9]FengW，LiW，Liu W，et al.IL-17 inducesmyocardial fibrosis and enhances RANKL/OPG and MMP/TIMP signaling in isoproterenol-induced heart failure[J].Exp Mol Pathol，2009，87（3）：212-218.

[10]Voloshenyuk TG，Hart AD，Khoutorova E，et al.TNF-α increases cardiac fibroblast lysyl oxidase expression through TGF-βand PI3Kinase signaling pathways[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，413（2）：370-375.

[11]Picard F，Brehm M，Fassbach M，et al.Increased cardiac mRNA expression of matrix metalloproteinase-1 （MMP-1） and its inhibitor（TIMP-1） in DCM patients[J].Clin ResCardiol，2006，95（5）：261-269.

[12]Halapas A，Zacharoulis A，Theocharis S，et al.Serum levels of the osteoprotegerin， receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，metalloproteinase-1 （MMP-1） and tissue inhibitors of MMP-1 levels are increased in men 6 months after acute myocardial infarction[J].Clin Chem Lab Med，2008，46（4）：510-516.

Effect of Shengmai Oral Liquid on TNF-α-induced collagen synthesis in cardiac fibroblasts for rats

WANG Jingchun1 XU Bo2 ZHANG Chun1
1.Department of Pharmacology,Qiqihar Medical College,Heilongjiang Province,Qiqihar 161006,China;2.Pharmacy Teaching and Research Section,Qiqihar Health School,Heilongjiang Province,Qiqihar 161005,China

Objective To explore the effect and mechanism of Shengmai Oral Liquid on collagen synthesis of neonatal rat cardiac fibroblasts(CFs)induced by tumor necrosis factor(tumor necrosis factor α,TNF-α).MethodsCardiac fibroblasts(CFs)were treated with different concentrations of ShengmaiOral Liquid drug-loaded serum plus TNF-αtreatment in vitro.Hydroxyproline content,MMP1 mRNA and TIMP1 mRNA expression were assayed by spectrophotometry and real-time quantitative reverse transcription-PCR,respectively.ResultsThe content of hydroxyproline in cardiac fibroblasts treated with TNF-αwas higher than the control group.The content of hydroxyproline was reduced in Shengmai Oral Liquid drugloaded serum group compared with the TNF-αgroup.MMP1 and TIMP1mRNA expression was up-regulated expression in TNF-αgroups compared with the control group.MMP1mRNA expression was up-regulated and TIMP1 was down-regulated in Shengmai Oral Liquid drug-loaded serum group compared with the TNF-αgroup.ConclusionTheResultsreveal that Shengmai Oral Liquid can inhibit the collagen synthesis in cardiac fibroblasts,and may correlate with down-regulate expression of TIMP1mRNA and up-regulate expression of MMP1mRNA.

Cardiacmuscle fiber;ShengmaiOral Liquid;TNF-α;Collagen synthesis

R541.61

A

1673-7210（2012）12（a）-0024-03

黑龍江省教育廳科學技術研究項目（項目編號：12511627）。[作者簡介]王敬春（1974-），男，生物學碩士，講師；研究方向：心肌纖維化的發病機制和防治策略。

2012-09-05 本文編輯：衛 軻）