HPLC法同時測定皺皮木瓜中原兒茶酸和綠原酸的含量

李 霞 楊穎博 李君麗 陳 程 陳萬生 孫連娜▲

1.第二軍醫大學藥學院，上海 200433；2.第二軍醫大學附屬長征醫院藥學部，上海 200403

HPLC法同時測定皺皮木瓜中原兒茶酸和綠原酸的含量

李 霞1，2楊穎博2李君麗1陳 程1陳萬生2孫連娜1▲

1.第二軍醫大學藥學院，上海 200433；2.第二軍醫大學附屬長征醫院藥學部，上海 200403

目的 建立皺皮木瓜中主要有效成分原兒茶酸和綠原酸的高效液相色譜含量測定方法。 方法 采用Dikma Diamonsil C18色譜柱 （4.6mm×250.0mm，5 μm），甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脫，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：254 nm。 結果 原兒茶酸在 16.66～533.00 μg（r=0.999 9），綠原酸在 23.91～765.00 μg（r=0.999 5），線性關系良好；兩個化合物的平均回收率分別為100.11%（RSD=0.90%，n=6）及99.06%（RSD=0.52%，n=6）。 結論 該方法簡便快速，分離效果好，靈敏度高，重現性好，可為全面控制皺皮木瓜質量提供參考。

木瓜藥材；高效液相色譜法；含量測定；原兒茶酸；綠原酸

皺皮木瓜為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥成熟果實，主產安徽、山東、浙江、湖北、云南、貴州、四川等地。皺皮木瓜作為一種常用中藥，味酸，性溫，入肝、脾經，具有舒筋活絡、和胃化濕的功效，主治風濕痹痛、肢體酸重、筋脈拘攣、吐瀉轉筋、腳氣水腫等癥，臨床主要用于治療腰酸腿痛、霍亂、風濕性關節炎、四肢轉筋、大吐瀉、腳氣水腫等疾病[1]。相關學者從木瓜中先后分離得到了有機酸類、三萜類、黃酮類等多種化學成分[2]。

筆者在對皺皮木瓜的研究中發現綠原酸與原兒茶酸是其中的主要成分。綠原酸，具有廣泛的利膽、抗菌、抗病毒、升高白細胞等作用；原兒茶酸，具有增加冠脈流量、降低心肌耗氧量、緩解心絞痛等作用[3-6]。目前國內關于皺皮木瓜藥材酚酸類成分的含量測定方法的文獻報道較少[7-11]，尚未見有關同時測定木瓜藥材中綠原酸和原兒茶酸含量的文獻報道。本文采用高效液相色譜法同時測定了木瓜藥材中綠原酸與原兒茶酸的含量，為評價和控制木瓜藥材的質量提供了依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters液相色譜儀（PDA檢測器），Empower工作站；Sartorious BT 25S型1/10萬電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；2500DE型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

原兒茶酸、綠原酸對照品均為自制（色譜檢查純度大于98%），甲醇為色譜醇，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。16批木瓜藥材主要由山東、河南、安徽、四川等產地收集，經第二軍醫大學張漢明教授鑒定分別為皺皮木瓜Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai和光皮木瓜 C.sinensis（Thouin）Koehne的干燥近成熟果實，見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma Diamonsil C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸（A）-甲醇（B）梯度洗脫，20%～25%A（0～25min），25%A（26～35 min），25%～20%A（36～40 min）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL。依上述色譜條件，分別精密吸取原兒茶酸和綠原酸對照品溶液和供試品溶液各20μL，分別進樣。在對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應位置上，有相同保留時間的色譜峰，見圖l。

表1 木瓜藥材信息表

2.2 供試品溶液的制備

取木瓜藥材細粉1 g，精密稱定，置具塞玻璃瓶中，精密加入20%甲醇20 mL，稱定重量，浸泡過夜后，超聲提取30min，放冷，再次稱定重量，用20%甲醇補足重量，過濾，取續濾液過0.45μm微孔濾膜再過濾，作為供試品溶液置于4℃冰箱保存。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取干燥后的原兒茶酸和綠原酸對照品分別為5.33、7.65mg，用20%甲醇溶解定容至10mL容量瓶，0.45μm微孔濾膜過濾，續濾液即為對照品溶液。

2.4 線性關系考察

將原兒茶酸、綠原酸對照品儲備液按 1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32比例制成6個不同濃度的對照品溶液，各依法進樣20μL，測定各色譜峰峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度（mg/mL）為橫坐標，進行線性回歸分析，結果見表2。

表2 四種對照品的回歸方程和線性范圍

2.5 精密度考察

取木瓜藥材細粉按“2.2”項下方法，制備供試品溶液。在“2.1”項下色譜條件，取供試品溶液進樣20μL，連續進樣6次，記錄峰面積，測定原兒茶酸和綠原酸色譜峰峰面積的RSD分別為1.58%和1.03%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定性考察

取“2.5”項下供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、8、16、24 h安排進樣，每次20μL，記錄峰面積，測定原兒茶酸、綠原酸色譜峰峰面積的RSD分別為1.83%和1.64%，表明樣品在24 h內基本穩定。

2.7 重復性考察

取同一批木瓜藥材細粉，精密稱定6份，按“2.2”項下制備6份供試品溶液，平行測定，計算原兒茶酸平均含量為0.054（RSD=1.27%），綠原酸平均含量為 0.152（RSD=1.78%），表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率考察

稱取已知含量的木瓜藥材細粉6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入一定濃度的兩個對照品，按“2.2”項下制成供試品溶液，每份樣品進樣20μL，進行測定，計算回收率。結果見表 3、4。

表3 原兒茶酸加樣回收率

表4 綠原酸加樣回收率

2.9 樣品含量測定

精密稱取16批不同產地及品種木瓜藥材各3份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行測定，以外標法計算兩種成分的含量，結果見表5。

表5 樣品含量測定結果

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 流動相的選擇 預實驗中分別考察了甲醇-水系統，乙腈-水系統和甲醇-0.1%甲酸水系統，發現甲醇-0.1%甲酸水系統分離效果比較好，各色譜峰都得到了較好的分離，為了保證在適宜的分析時間內使各色譜峰均達到較好的分離，故采用甲醇-0.1%甲酸水系統梯度洗脫。

3.1.2 檢測波長的選擇 實驗中用紫外分光光度計檢測了原兒茶酸和綠原酸的檢測波長，發現原兒茶酸在254 nm處有最大吸收，綠原酸的最大吸收雖然在327 nm，但是在254 nm處有肩峰，為了同時檢測兩個化合物的含量，故選擇254 nm為檢測波長。

3.1.3 柱溫的考察 實驗中考察了25、30、35℃三種柱溫，結果表明：溫度為30℃時，原兒茶酸和綠原酸的分離度較好。

3.1.4 流速的考察 實驗中考察了不同的流速。當流速為0.8mL/min時，峰形展寬；流速為1.2mL/min時，峰形改善不大，考慮到柱壓，最終確定流速為1.0mL/min。

3.2 含量測定結果分析

根據樣品測定結果，不同品種的木瓜藥材成分有明顯差異，在皺皮木瓜中都含有化合物原兒茶酸和綠原酸，而光皮木瓜中只有原兒茶酸，未檢測到綠原酸。而不同產地的相同品種的木瓜藥材中這兩種成分的含量差異也比較大，山東各產地的皺皮木瓜中原兒茶酸和綠原酸成分的含量相對較高，各產地氣候、土壤等環境條件可能是影響含量的重要因素。

本研究同時測定了木瓜藥材中主要成分原兒茶酸、綠原酸的含量，結果顯示該方法靈敏度高，重復性好，樣品處理方法簡單，為木瓜藥材的質量控制提供了參考依據。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：57.

[2]吳虹，魏偉，吳成義.木瓜化學成分及藥理活性的研究[J].安徽中醫學院學報，2004，23（2）：62-64.

[3]國家醫藥管理局中草藥情報中心站.植物藥有效成分手冊[M].北京：人民衛生出版社，1998：209-210.

[4]季字彬.中藥有效成分藥理與應用[M].哈爾濱：黑龍江科學技術出版杜，1995：110.

[5]江蘇省植物研究所，中國科學院昆明植物研究所，中國醫學科學院藥用植物資源開發研究所.新華本草綱要[M].3冊.上海：上海科學技術出版社，1990：95.

[6]饒曼人.原兒茶酸對缺血區心肌代謝及心肌梗塞范圍的影響[J].中國藥理學報，1988，9（1）：27-30.

[7]龔復俊，陳玲，盧笑叢，等.皺皮木瓜果實中有機酸成分的GC-S分析[J].植物資源與環境學報，2005，14（4）：55-56，58.

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Simultaneous determ ination of protocatechuic acid and chlorogcnic acid in Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakaiby HPLC

LIXia1,2 YANG Yingbo2 LIJunli1 CHEN Cheng1 CHENWansheng2 SUN Lianna1▲
1.SchoolofPharmacy,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai 200433,China;2.DepartmentofPharmacy,Changzheng Hospital Affiliated to the Second Military Medical University,Shanghai 200403,China

Objective To develop an HPLCmethod for the simultaneous quailtitation of protocatechuic acid and chlorogcnic acid in Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai.MethodsSamples were analyzed on Dikma Diamonsil C18column(4.6 mm×250.0mm,5μm),eluted withmethanol and water containing 0.1%formic acid asmobile phases in a linear gradientmode.The flow rate was kept at 1.0 mL/min and the column temperature was set to 30℃,the detector wavelengthswere 254 nm.ResultsThe linear rangeswere 16.66-533.00μg(r=0.999 9)for protocatechuic acid,23.91-765.00μg(r=0.999 5)for chlorogcnic acid.The average recoveries of the two constituents were 100.11%(RSD=0.90%,n=6),99.06%(RSD=0.52%,n=6),respectively.ConclusionThemethod is sensitive,accurate,repeatable,and can be used for quality control of the fruits of Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai.

Chaenomeles speciosa;HPLC;Content determination;Protocatechuic acid;Chlorogcnic acid

O657.63

A

1673-7210（2012）12（a）-0110-03

國家科技重大專項子課題-重大新藥創制項目（項目編號：2011 ZX09102-006-03）。

李霞（1982-），女，碩士研究生，主管藥師；研究方向：天然產物化學與中藥新藥。

▲通訊作者

2012-09-19 本文編輯：衛 軻）