99Tcm 標記右旋糖苷衍生物的制備及其生物分布

楊春慧 ，李洪玉，梁積新，魯 佳，羅洪義，鄭德強，孫桂全

（1.中國原子能科學研究院 同位素研究所 北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413）

放射導向的前哨淋巴結活組織切片檢查（SLNB）是一種在早期乳腺癌和黑色素瘤處置方面被廣泛認可的技術，尤其在腫瘤發病初期，可以用于檢測位于隱匿性區域的前哨淋巴結并對其是否發生癌轉移進行評估，對治療方案的選擇具有重要意義［1－2］。SLNB可用于評估乳腺癌、口腔癌、宮頸癌和其他生殖泌尿系統腫瘤的轉移情況。

目前，臨床上常用的前哨淋巴結（SLN）顯像劑大多為非特異性，且顯像效果欠佳。99Tcm標記的納米顆粒類藥物被廣泛用于SLN 檢測，其攝取機理主要基于淋巴結內巨噬細胞的吞噬作用將藥物滯留在SLN 內，但顯像效果仍不夠理想，主要缺點是：特異性不強，在注射點的濃集高，分子顆粒大小不均，易發生放射性從SLN 到次級淋巴結（2LN）的遷移，致使次級淋巴結顯像不清晰，需要嚴格控制顯像及活檢時間［3］。

右旋糖苷作為一種非常便利的分子骨架，可修飾不同的化學基團，并表現出不同的分子性質。最近的研究［4－5］表明，99Tcm標記甘露糖基化的大分子如人血清白蛋白、右旋糖苷等，可與淋巴結巨噬細胞表面的受體結合，且其分子大小較為確定，攝取性能較好。LymphoseekTM（99Tcm－DTPA－甘露糖基化右旋糖苷）作為一種具有受體結合性質的顯像劑被用于SLN 檢測，目前在國外已完成了三期臨床研究。其他相關的生物實驗和顯像研究表明，該類標記物在淋巴結的攝取可能受到分子大小、電荷、受體作用機制等因素的影響［6－7］。

羰基锝［99Tcm（CO）3］＋具有許多優良的性質，如：化學性質較穩定，核結構較緊密，與適當的配體結合后可保護中心锝核不受其他配體的進攻，從而有利于整個配合物的穩定；分子較小，對多肽等生物分子的生物活性影響較小，應用范圍較廣等。更為有利的是，羰基锝可通過Isolink藥盒很方便地制得。因此，本研究擬選用羰基锝做中心核進行標記物的生物分布實驗，并比較甘露糖基對標記物在體內分布及淋巴結攝取的影響，以及由于起始右旋糖苷相對分子質量的不同對標記物體內分布及淋巴結攝取產生的影響。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

99Mo－99Tcm發生器：原子高科股份有限公司；FH463A 自動定標器、FT－603型閃爍探頭：北京核儀器廠；CRC 15R 放射性活度計：美國CAPINTEC公司；微量注射器：美國Hamilton公司；高效液相系統：ProStar 210型，美國Varian公司；HPLC 放射性檢測器：德國Raytest公司；Milli－Q高純水制備系統：MILLIPORE公司。

1.2 主要試劑

右旋糖苷衍生物：希臘放射性核素和放射性顯像產品研究所的Ioannis Pirmettis博士合成，法國的Roberto Pasqualini博士提供；Isolink藥盒：由Mallinckrodt－Tyco公司生產并贈送。其他試劑均為國產分析純，實驗用水均為二次去離子水。

1.3 實驗動物

Balb／c小鼠：60只，18～22g，雌雄不限，清潔級，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供。

2 實驗方法

2.1 羰基锝［99Tcm（CO）3（H2O）3］＋的制備

Isolink藥盒的主要成分為：4.5mg硼氫化鈉、7.15mg碳酸鈉、8.5mg二水合硼酸鈉、2.85mg十水合硼酸鈉。標記時，向Isolink 藥盒中加入1 mL Na99TcmO4洗脫液（37～370MBq），于95℃反應25～30min，間歇振蕩，反應結束后，冷卻至室溫，用約0.2 mL PBSHCl緩沖液（0.64 mol／L，pH 為2.5）調節pH為7.5～8.5。

2.2 右旋糖苷衍生物的99Tcm 標記

選取兩組右旋糖苷衍生物進行對比，分別為不含甘露糖基的右旋糖酐衍生物DC（Dextranpropyl－S－Cysteine）和含甘露糖基的右旋糖酐衍生物DCM（Dextran－S－Cysteine－Mannose）。DC－1和DCM－1為第一組對比物（起始右旋糖苷的相對分子質量約為11 800）；DC－2和DCM－2為第二組對比物（起始右旋糖苷的相對分子質量約為20 000，）；另外，4種對比物分子上都修飾了半胱氨酸以提供羰基锝的結合位點。DC 和DCM 類衍生物的化學結構示于圖1。標記方法參考文獻［8］。將羰基锝［99Tcm（CO）3（H2O）3］＋分別加入到含有400μg DC－1、DCM－1、DC－2 和DCM－2 凍干 品瓶中，反應混合物于75℃反應30min。得到99Tcm－（CO）3－DC－1、99Tcm－（CO）3－DC－2、99Tcm－（CO）3－DCM－1 和99Tcm－（CO）3－DCM－2。將標記溶液用生理鹽水稀釋80倍，于室溫下靜置5h，用HPLC 分析其放化純度。

2.3 標記物放化純度的測定

采用高效液相色譜法（HPLC）分析標記物的放化純度：C18色譜柱（Hypersil ODS2，φ4.6mm×250mm）為分離柱，紫外檢測器波長選擇254nm，流速為1mL／min。分析條件為：流動相A ：0.1%TFA／H2O，B：0.1%TFA／MeOH；淋洗梯度：0～4 min，0～0%B；4～6min，0～25%B；6～17 min，25%～100%B；17～25min，100%B；25～30min，100%～0B；30～35min，0%B。

2.4 標記物在正常小鼠體內的生物分布

取健康Balb／c小鼠60只，隨機分為12組，每組5只。將標記物用生理鹽水稀釋（pH 6～7.5），由小鼠的右后足腳墊皮下進行注射。注射液濃度為3～37GBq／L，當注射劑量為0.01g／L時，注射體積為5μL；當注射劑量為0.1g／L時，注射體積為20 μL。注射后按摩腳掌0.5min，分別于處死前10min在給藥一側的腳墊處皮下注入專利藍溶液，再按摩腳掌0.5min。給藥后1、4h處死小鼠，取前哨淋巴結（即腘窩淋巴結）、次級淋巴結（即腰淋巴結）、注射點（即右后足）、肝、脾、血等，測量其放射性計數，計算組織或器官的放射性攝取率。

圖1 右旋糖苷衍生物DC和DCM 的化學結構

3 結果與討論

3.1 右旋糖苷衍生物化合物的99Tcm 標記

羰基锝［99Tcm（CO）3（H2O）3］＋以及標記產物HPLC分析譜圖示于圖2。由圖2結果可計算得，采用Isolink藥盒制備的羰基锝的放化純度≥95%；而右旋糖苷衍生物經羰基锝標記，放化純度也均＞90%。

將99Tcm－（CO）3－DCM－1標記溶液用生理鹽水稀釋80倍，于室溫下靜置5h，放化純度未見降低，仍＞90%，說明所得99Tcm－（CO）3－DCM－1體外穩定性較好。

3.2 標記物在正常小鼠體內的生物分布

99Tcm－（CO）3－DC 和99Tcm－（CO）3－DCM 在注射劑量為0.01g／L 時，給藥后4h，正常Balb／c小鼠體內的生物分布列于表1；注射劑量為0.1g／L時，給藥后1h和4h，小鼠體內的生物分布結果分別列于表2和表3。

圖2 標記物的HPLC譜圖

表1 注射劑量為0.01g／L時給藥4h后標記物在正常小鼠體內的生物分布（±s，n＝5）

表1 注射劑量為0.01g／L時給藥4h后標記物在正常小鼠體內的生物分布（±s，n＝5）

注1）：SLN、2LN、注射點攝取率的單位為%ID；肝、脾、血攝取率的單位為%ID·g－1

表2 注射劑量為0.1g／L時給藥1h后標記物在正常小鼠體內的生物分布（±s，n＝5）

表2 注射劑量為0.1g／L時給藥1h后標記物在正常小鼠體內的生物分布（±s，n＝5）

注1）：SLN、2LN、注射點攝取率的單位是%ID；肝、脾、胃、血和小腸攝取率的單位是%ID·g－1

表3 注射劑量為0.1g／L時給藥4h后標記物在正常小鼠體內的生物分布（±s，n＝5）

表3 注射劑量為0.1g／L時給藥4h后標記物在正常小鼠體內的生物分布（±s，n＝5）

注1）：SLN、2LN、注射點攝取率的單位是%ID；肝、脾、胃、血和小腸攝取率的單位是%ID·g－1

表1結果顯示：99Tcm－（CO）3－DC－1和99Tcm－（CO）3－DC－2 標記物在SLN攝取較低，99Tcm－（CO）3－DCM－1 和99Tcm－（CO）3－DCM－2 在SLN攝取較高，差異有統計學意義（P＜0.000 5），但同時在注射點的滯留也相應增加。比如給藥后4h，99Tcm－（CO）3－DC－2在SLN的攝取率為0.41%，在注射點的攝取也僅為14.44%；而當DC－2分子上連接甘露糖基后得到的DCM－2，其標記物99Tcm－（CO）3－DCM－2在SLN的攝取增加到14.91%，在注射點的攝取也增加到58.03%。差異有統計學意義（P＜0.000 5）。分子中含有甘露糖基時，SLN 的攝取率大幅提高，表明分子中的甘露糖基對淋巴結巨噬細胞的受體具有親和作用。

由表2和表3可見，當注射劑量為0.1g／L時，99Tcm－（CO）3－DCM 較99Tcm－（CO）3－DC 具有更高的SLN 攝取，其差異存在顯著性（P＜0.000 5），且表現出較高的肝、脾攝取，這可能是由于在動物腳掌這樣一個相對狹小的范圍里皮下注射，注射化學量及體積較大時，淋巴結處于一種過飽和狀態，因此不能滯留的藥物顆粒會經淋巴管進入血液，并最終停留在肝和脾內。而注射點放射性偏高，一方面是由于注射的化學量增加，另一方面可能由于注射液經稀釋后，可能產生一些分子顆粒的聚集，造成注射點濃集增加。

對于前哨淋巴結顯像而言，注射劑量是一個很關鍵的影響因素［9］。本研究顯示了類似的結果，注射劑量降低為0.01g／L 時，在SLN 攝取提高的同時，肝攝取有了大幅降低，表明以小鼠為研究對象時，適當降低注射化學量或注射體積，選擇合適的注射劑量，有利于標記物體內分布性質的改善。

另外，標記物的相對分子質量不同，也會造成不同的生物分布結果，總體來說，同類分子中相對分子質量較大的分子，在各種組織內的攝取都會有相應增加，差異顯著（P＜0.005）。比如99Tcm－（CO）3－DCM－2較99Tcm－（CO）3－DCM－1在注射劑量為0.01g／L 時，SLN 攝取高出兩倍多。

4 結論

本研究用羰基锝標記了4種右旋糖苷衍生物，放化純度均＞90%。小鼠體內分布結果表明，含甘露糖基的右旋糖苷衍生物相比于不含甘露糖基的右旋糖酐衍生物具有更好的SLN 攝取率，體現了甘露糖基對淋巴結巨噬細胞的受體親和作用；另外，起始右旋糖苷相對分子質量較高的標記化合物，SLN 攝取更高；標記物的注射劑量也會對SLN 攝取產生較大影響。

99Tcm標記的甘露糖基化右旋糖苷衍生物其分子大小較為確定，SLN 攝取性能較好，值得進一步研究。

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