放射敏感性啟動子調(diào)控CD基因／5－FC自殺系統(tǒng)慢病毒載體的構(gòu)建及125I誘導表達的研究

李 玲，張春麗，閆 平，殷 雷，康 磊，趙 倩，王榮福

（北京大學 第一醫(yī)院 核醫(yī)學科，北京 100034）

放射敏感性基因“啟動子”序列可在電離輻射作用下誘導下游基因表達，將放射敏感性啟動子序列連接于自殺基因DNA 的上游，構(gòu)建重組慢病毒載體，包裝重組慢病毒顆粒，以重組慢病毒感染細胞，以放射性核素的電離輻射作用作為啟動自殺基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)，在空間和時間上調(diào)控自殺基因的表達，通過放射性核素的電離輻射效應(yīng)聯(lián)合基因治療，可在腫瘤組織局部產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤細胞作用，從而在提高對腫瘤組織的殺傷作用的同時，減少輻射損傷和化療藥物治療造成的全身毒副效應(yīng)［1］。

Marples、Scott［2－3］等的研究發(fā)現(xiàn)，上游基因序列含CArG 元件即CC（A／T）6GG 序列，可在電離輻射誘導下成功誘導下游基因表達，與電離輻射可誘導的野生Egr－1基因上游啟動子相比，含4個及以上CArG 元件的合成啟動子在受到相同劑量輻射時，其下游基因表達明顯增加，P＜0.05；而含有6～9個CArG 元件時，報告基因表達可增至最高。

胞嘧啶脫氨酶（Cytosine Deaminase，CD）／5－FC（5－Fluorocytosine，5－氟胞嘧 啶）為目 前研究最多的自殺基因／前藥系統(tǒng)之一。CD 基因表達產(chǎn)物為胞嘧啶脫氨酶，能將抗真菌藥物5－FC轉(zhuǎn)化為細胞毒性藥物5－FU（5－Fluorourial，5－氟尿嘧啶），5－FU 在細胞內(nèi)的代謝物通過插入DNA 或RNA 鏈，抑制DNA 或蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮殺滅細胞作用。同時5－FU 也是一種放療増敏劑，其増敏機理可能為減少細胞核酸形成、抑制細胞修復、減少S期的抗放療細胞。且有文獻［4］報道，在CD／5－FC 基因治療中，僅2%～10%的腫瘤細胞表達CD 基因，就可明顯抑制腫瘤生長，稱之為基因治療的“旁觀者效應(yīng)”。

慢病毒（Lentivirus）載體是近年來以HIV－1（人類免疫缺陷Ⅰ型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，可將外源基因有效地整合到宿主細胞的染色體上，從而達到持久性表達，因其去除了毒性基因，故安全性高，因而在基因治療方面得到了廣泛的應(yīng)用［5］。

本工作擬構(gòu)建含放射性啟動子E8、自殺基因CD 基因及報告基因GFP（Green Fluorescent Protein，綠色熒光蛋白）基因的重組慢病毒載體，包裝成重組慢病毒顆粒E8－codA－GFP LV，感染EJ細胞，以放射性核素125I誘導合成的放射敏感性啟動子E8（含8個CArG 元件的DNA序列）啟動CD 基因及GFP 基因表達，將5－FC轉(zhuǎn)化成5－FU，并表達綠色熒光，通過細胞體系中5－FU 的檢測及對綠色熒光表達的觀察，以驗證構(gòu)建的放射敏感性啟動子E8 調(diào)控CD 基因／5－FC自殺系統(tǒng)慢病毒載體具有電離輻射調(diào)控作用。

1 實驗材料

1.1 主要試劑與材料

慢病毒表達質(zhì)粒pGC－FU－GFP 載體、慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)粒pHelper 1.0 載體及慢病毒包膜蛋白質(zhì)粒pHelper 2.0載體（含VSVG 元件）：GeneChem公司產(chǎn)品；含CD基因的pCD2質(zhì)粒：ATCC公司產(chǎn)品；293T 細胞：上海吉凱基因技術(shù)有限公司提供；LipofetamineTM2000：Invitrogen公司產(chǎn)品；膀胱癌EJ細胞：北京大學醫(yī)學部病理教研室提供；Plasmid 抽提試劑盒：Promega公司產(chǎn)品；TRIZOL 試劑盒：Invitrogen公司產(chǎn)品。AgeⅠ酶、PacⅠ／Bam H Ⅰ酶：NEB公司產(chǎn)品。

5－FC、5－FU：Sigma公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基及FBS（Fetal Blood Serum，胎牛血清）：Hyclone公司產(chǎn)品；ENi.s、Polybrene：上海吉凱基因技術(shù)有限公司提供；Na125I溶液（2.22TBq／L，放化純度＞99%）：原子高科股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PCR 儀：Applied Biosystems公司 產(chǎn) 品：穩(wěn)壓DNA 電泳儀：BioRad公司產(chǎn)品；高速離心機：日立公司產(chǎn)品；凝膠成像儀：天能公司產(chǎn)品；Class－VP SCL－10AVP HPLC分析型：島津公司產(chǎn)品；VenusilMPC－18制備色譜柱（10mm×250mm，5μm）：Alltech 公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡：奧林巴斯公司產(chǎn)品；COM2 培養(yǎng)箱：Thermo公司產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 重組慢病毒載體構(gòu)建與重組慢病毒包裝

2.1.1 CD 基因獲取、擴增及載體pGC－FU－codA－GFP制備

根據(jù)已知GeneBank 中CD 基因序列設(shè)計合成引物，分別在引物上下游加入AgeⅠ酶切位點，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。其引物序列：CD基因序列－Age Ⅰ－F 為5’GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTC GAATAACGCTTTACAAAC3’；CD基因序列－AgeⅠ－R為5’TCACCATGGTGGCGACCGGACGTTTGTAATCGATGGCTTC3’。以含CD 基因序列 的質(zhì)粒pCD2為模板，PCR擴增，獲取CD基因cDNA。PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應(yīng)）反應(yīng)條件：94℃變性5 min；設(shè)置參數(shù)：94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min，循環(huán)30次；最后72℃延伸10min。電泳鑒定PCR 產(chǎn)物。

AgeⅠ酶切消化pGC－FU 載體，使含GFP基因的慢病毒載體線性化后，加入純化的PCR產(chǎn)物，使之通過交換進入線性化慢病毒載體。其反應(yīng)體系包括2.5μL 雙蒸水、2μL n－Fusion交換酶緩沖液、5μL線性化載體DNA、10μL純化的PCR 產(chǎn)物、0.5μL In－Fusion交換酶，總體積20μL。于25℃下反應(yīng)30min，再加熱至42℃反應(yīng)15min，制得交換液，轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2處理過的大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，PCR 鑒定細菌陽性克隆，接種陽性轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，獲得載體pGC－FU－codA－GFP，并由上海美季生物技術(shù)有限公司測序驗證。

2.1.2 放射性啟動子E8 合成及慢病毒載體pGC－FU－E8－codA－GFP制備

化學合成含8個CArG 元件的啟動子，兩端為PacⅠ／BamHⅠ酶切位點，其序列為5’TTAATTAACCGCGGCCTTATTTGGCCT TATTTGGCCTTATTTGGCCTTATTTGGCCTTATTTGGCCTTATTTGGCCTTATTTG GCCTTATTTGGCCGCGGGGATCC3’，由Invitrogen公司合成。Pa cⅠ／Bam H Ⅰ酶切化學合成的含有目的基因的質(zhì)粒。Pac Ⅰ／BamHⅠ酶切消化pGC－FU－codA－GFP使之線性化后，加入酶切的啟動子DNA 片段，制備pGC－FUE8－codA－GFP。其反應(yīng)體系包括：13.5μL ddH2O、2μL T4DNA 連接酶緩沖液、2μL 50%PEG4000、1μL酶切載體DNA、0.5μL 酶切純化的PCR 產(chǎn)物、1μL T4DNA 連接酶，總體積20μL。于22℃下連接3h，之后轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2處理過的大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，PCR 鑒定細菌陽性克隆，接種陽性轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，獲得載體pGC－FU－E8－codA－GFP，由上海美季生物技術(shù)有限公司測序驗證。

2.1.3 重組慢病毒包裝

將重組慢病毒載體pGC－FU－E8－codAGFP、空載慢病毒載體pGC－FU 載體以及慢病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，按Lipofectamine2000試劑使用說明，分別用重組載體、空載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細胞，培養(yǎng)8h后去除轉(zhuǎn)染液，更換為原培養(yǎng)液。于轉(zhuǎn)染后48h收集細胞上清液，4℃、4 000g離心10min，除去細胞碎片，以0.45μm 濾器過濾上清液，濃縮后獲得純化含目的基因的重組慢病毒濃縮液及僅含GFP基因的空載慢病毒濃縮液，即E8－codA－GFP LV 及GC－FU－GFP LV，各自分裝后存于－80℃中備用。

2.2 慢病毒滴度測定

用逐孔稀釋法測定慢病毒滴度：將處于對數(shù)生長期的293T 細胞按每孔1×105個細胞接種于24 孔板中。取病毒濃縮液用ENi.s（Enhanced Infection Solution，感染增強液）按10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6進行梯度稀釋后感染細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，換液。4d后，觀察空載慢病毒組熒光表達情況，并計算空載慢病毒滴度。重組目的基因慢病毒組用Realtime 定量PCR 法測定E8－codA－GFP LV 滴度：抽提E8－codA－GFP LV 感染組細胞總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用Realtime 定 量PCR 法檢測GFP 基因表達，以ACTIN 作為內(nèi)參照。

2.3 慢病毒感染EJ細胞

人膀胱癌EJ細胞培養(yǎng)：用含10%FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基將EJ細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。將生長狀態(tài)良好的EJ細胞按每孔3×103個接種于96孔板上，至細胞融合率達50%時，用ENi.s稀釋空載病毒原液，以MOI（Multiplicity of Infection，感染復數(shù)）值為1、10、20、40、60、80、100感染EJ細胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，確定EJ細胞最佳MOI值。目的慢病毒E8－codA－GFP LV 用ENi.s稀釋，以最佳MOI值感染EJ細胞。

2.4 熒光顯微鏡觀察綠色熒光

E8－codA－GFP LV 感染EJ細胞后48h，吸棄原培養(yǎng)液，分別加入0、18.5、37.0、55.5、74.0kBq用培養(yǎng)液稀釋過的Na125I，補足培養(yǎng)液至終體積為100μL。繼續(xù)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后置于熒光顯微鏡下觀察。

2.5 HPLC檢測細胞上清液中的5－FU

E8－codA－GFP LV 感染EJ細胞后48h，吸棄原培養(yǎng)液，將感染細胞分為11 組，1～5 組分別加入0、37、74、111、148kBq Na125I，每組同時加入40μL 5－FC（1g／L），6～10組每組分別加入0、37、74、111、148kBq Na125I，第11組僅加入40μL 5－FU（1 mg／mL），各孔補足培養(yǎng)液至總體積100μL，繼續(xù)培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。48h 后，吸取上清液，以乙腈和水為展開劑，用HPLC法分離并觀察細胞上清液中5－FU紫外峰。

3 結(jié)果與討論

3.1 慢病毒載體構(gòu)建與DNA 測序

以pCD2質(zhì)粒為模板，PCR 擴增CD 基因序列，結(jié)果示于圖1。由圖1 可知，擴增產(chǎn)物大小約1 327bp。

PacⅠ／Bam H Ⅱ酶切凝膠電泳圖示于圖2。由圖2可知，PacⅠ／Bam H Ⅰ酶切化學合成的含有啟動子序列的質(zhì)粒，其酶切片段大小96bp。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α 后，PCR 鑒定細菌陽性克隆。陽性轉(zhuǎn)化子進行DNA 測序比對，結(jié)果顯示，重組慢病毒載體pGC－FU－E8－codA－GFP質(zhì)粒中含有合成正確的8個CC（A／T）6GG 放射敏感性啟動子序列及目的基因codA，與Gennebank中X63656.1序列基本一致（CD 基因為原核生物大腸桿菌E.coli中獲得，其起始密碼子為GUG，而真核生物中起始密碼子為AUG，故第一位堿基由基因收錄庫中的G 突變?yōu)锳）［6］。

圖1 CD基因PCR 產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖2 E8啟動子酶切凝膠電泳圖

3.2 慢病毒滴度測定結(jié)果

空載慢病毒載體及重組目的慢病毒載體分別與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細胞，成功獲得空載慢病毒及重組目的慢病毒顆粒。經(jīng)逐孔稀釋法轉(zhuǎn)染293T 細胞后，通過觀察感染細胞各組綠色熒光表達，計算得到空載慢病毒液滴度為2×109TU／mL。通過Realtime定量PCR法檢測，計算得到重組目的慢病毒液滴度為2×108TU／mL。

3.3 慢病毒轉(zhuǎn)染EJ細胞觀察綠色熒光表達

空載慢病毒以不同MOI值感染EJ細胞，熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達，結(jié)果顯示，MOI＝60（即每孔中慢病毒數(shù)／細胞數(shù)＝60）時熒光強度增至最高，其顯微圖像示于圖3。重組目的慢病毒感染EJ細胞，加入不同劑量125I后綠色熒光表達結(jié)果示于圖4。由圖4可見，125I用量對重組目的慢病毒感染EJ細胞的綠色熒光表達結(jié)果影響明顯，未加125I時，基本無熒光表達（圖4a）；隨著125I用量的增加，熒光表達也在逐漸增加，37.0Bq時即有明顯表達（圖4c），74.0kBq組（圖4e）熒光表達最明顯。可見，合成的放射敏感性啟動子可在低劑量放射性核素125I的電離輻射作用下誘導下游基因GFP基因表達。

3.4 HPLC結(jié)果

對2.5節(jié)中1～5組的細胞上清液及20μL 5－FC、5－FU 標準對照液進行HPLC 分析，結(jié)果顯示，于254nm 可觀察到紫外吸收峰，保留時間5min左右可觀察到5－FC峰，6min左右可觀察到5－FU 峰。加入不同劑量125I對400mg／L 5－FC組其HPLC 譜示于圖5。圖5 中，第一個峰為5－FC，第二個峰為5－FU。由圖5 可知，加入148kBq125I時，5－FU 紫外峰最為明顯（圖5d）。以上結(jié)果說明，在放射性核素125I誘導作用下，感染了目的慢病毒的EJ細胞能夠?qū)?－FC轉(zhuǎn)化成原本不存在的5－FU，且隨著125I劑量的增加，5－FC轉(zhuǎn)化生成5－FU 的量有所增加，加入148kBq125I時，5－FU 生成量最多。

圖3 空載慢病毒感染EJ細胞后的綠色熒光表達

圖5 不同劑量125I誘導E8－codA－GFP LV感染EJ細胞轉(zhuǎn)化5－FC為5－FU HPLC譜圖

4 結(jié)論

1）本實驗構(gòu)建的重組慢病毒載體pGC－FUE8－codA－GFP序列正確，并可成功包裝出滴度較高的慢病毒顆粒E8－codA－GFP LV。

2）重組慢病毒E8－codA－GFP LV 能夠感染人膀胱癌EJ細胞，實驗中設(shè)計合成的含8 個CArG 元件的放射敏感性啟動子序列在可在較低劑量放射性核素的電離輻射作用下誘導下游基因CD 基因及GFP基因的表達，成功將5－FC轉(zhuǎn)化成5－FU，并表達熒光蛋白。

以上結(jié)果提示，低能量的放射性核素125I在較低劑量下（37kBq）即可誘導放射敏感性啟動子E8調(diào)控下游基因表達，激活下游基因CD，將5－FC轉(zhuǎn)化成細胞毒性藥物5－FU。由此可見，若將發(fā)射低能量射線的放射性核素如125I連接于可與腫瘤細胞和組織特異性結(jié)合的單克隆抗體或者小分子上，在體內(nèi)靶向作用于轉(zhuǎn)入外源放射性增敏基因（如放射敏感性啟動子E8）及治療基因的腫瘤細胞，誘導治療基因表達，將無毒性前體藥物在腫瘤局部轉(zhuǎn)化成細胞毒性藥物，即可發(fā)揮放射免疫治療和基因治療的雙重作用，且可以通過自殺系統(tǒng)產(chǎn)生的“旁觀者效應(yīng)”進一步擴大其作用范圍，對未轉(zhuǎn)入外源基因的腫瘤細胞發(fā)揮作用，以達到降低細胞毒性藥物全身毒副作用時，在局部充分發(fā)揮其抗腫瘤作用。

但本實驗中尚存在諸多不足之處，如慢病毒感染細胞中導入的外源基因所需的表達時間較長。實驗中125I誘導下游基因的表達尚需要進一步探索更為合適的實驗條件，以觀察到更為全面的表達效果，還需要進一步研究125I劑量對基因表達的影響，為下一步的實驗提供更好的條件。

［1］王榮福，張春麗.電離輻射誘導啟動子Egr－1調(diào)控的基因放射治療［J］.腫瘤學雜志，2010，16（3）：238－241.

［2］Marples B，Scott SD，Hendry JH，et al.Development of synthetic promoters for radiation－mediated gene therapy［J］.Gene Ther，2000，7（6）：511－517.

［3］Scott SD，Joiner MC，Marples B.Optimizing radiation－responsive gene promoters for radiogenetic cancer therapy［J］.Gene Ther，2002，9（20）：1 396－1 402.

［4］Huber BE，Austin EA，Richards CA，et al.Metabolism of 5－fluorocytosine to 5－fluorouracil in human colorectal tumor cells transduced with the cytosine deaminase gene：Significant antitumor effects when only a small percentage of tumor cells express cytosine deaminase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（17）：8 302－8 306.

［5］Dropuli B.Lentiviral vectors：Their molecular design，safety，and use in laboratory and preclinical research［J］.Hum Gene Ther，2011，22（6）：649－657.

［6］Danielsen S，Kilstrup M，Barilla K，et al.Characterization of the Escherichia coli codBA operon encoding cytosine permease and cytosine deaminase［J］.Mol Microbiol，1992，6（10）：1 335－1 344.