177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠體內的生物分布和兔SPECT顯像研究

鄧新榮，向學琴，李鳳林，樊彩云，劉子華，陳 陽，羅志福，

（1.中國原子能科學研究院 同位素研究所，北京 102413；2.中國原子能科學研究院 核工業401醫院 核醫學科，北京 102413）

惡性腫瘤患者發生骨轉移的幾率較高，腫瘤轉移到骨上，會出現伴隨著骨質溶解性的骨破壞，其癥狀為骨痛、病理性骨折、脊椎壓迫和高鈣血癥。超過70%的骨轉移癌患者會出現劇烈而持續性骨痛，嚴重影響患者的生活質量［1］。

177Lu是一種很有潛力的放射性治療用核素。177Lu具有適宜的物理半衰期（6.7d），發射的β－粒子在組織中的平均射程小于200μm，適合殺死癌細胞。177Lu發射的γ射線可用于單光子發射計算機斷層成像術（Single－Photon Emission Computed Tomography，SPECT）顯像，以監測和指導治療過程。177Lu較長的半衰期為其生產、產品的質量分析和質量控制以及對遠離核素生產地點的供應提供了方便；也可減少多次注射給病人帶來的痛苦。177Lu可以通過反應堆輻照產生，具有低成本和易得性，因此適用于制備放射性藥物［2］。在治療骨轉移癌疼痛的應用中，177Lu 標記的膦酸鹽類化合物成為研究熱點［3－6］。

1，4，7，10－四氮雜環十二烷－1，4，7，10－四甲撐膦酸（1，4，7，10－tetraazacyclododecane－1，4，7，10－Tetraaminomethylenephosphonate，DOTMP）是1，4，7，10－四氮雜環十二烷（1，4，7，10－tetraazacyclododecane，cyclen）的一種衍生物，是一種多齒氨基亞甲基膦酸類配體，可與多種核素形成穩定配合物。近幾年，國外已經研究了應用不同放射性核素標記的DOTMP治療骨轉移癌引起的疼痛，并且取得了一些進展［7－10］。本研究擬以1，4，7，10－四氮雜環十二烷為主要原料合成DOTMP，對其進行177Lu 標記，并對177Lu－DOTMP在骨轉移癌模型鼠中的分布和在健康大白兔體內的顯像進行研究，考察其對骨的靶向性。

1 主要實驗材料

1.1 實驗試劑和實驗動物

1，4，7，10－四氮雜環十二烷：美國Sigma公司產品；天然三氧化二镥（Lu2O3）：美國Alfa Aesar產品；37%甲醛溶液（HCHO）、無水亞磷酸（H3PO3）、濃鹽酸（HCl）等試劑均為分析純，購于國藥集團北京化學試劑公司。

177LuCl3溶液：參考文獻［7］由反應堆制備177Lu，用1.0mL 0.2mol／L 鹽酸溶液溶解所得177Lu得到177LuCl3溶液，活度為919GBq。

小鼠S180肉瘤細胞：中國醫學科學院腫瘤醫院提供。

昆明小鼠：雄性，4～5 周齡，體重18～20g，25只，北京華阜康生物科技股份有限公司提供；日本大耳白兔：雄性，體重2.6kg，1只，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2 主要儀器

RE－52AA 旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；DF－2磁力加熱攪拌器：鄭州長城科工貿有限公司；AR2130電子天平：梅特勒－托利多儀器上海有限公司；XZ－2 真空油泵：上海真空泵廠；DZX－3真空干燥箱：上海福馬實驗設備有限公司；RM－905a放射性活度計：中國計量科學研究院；Wizard 1470 全自動γ 計數儀：美國Perkin Elmer公司產品；AR－2000放射性薄層掃描儀：美國Bioscan 公司；Mili－Q 超純水系統：美國Millipore公司；Whatman 濾紙（3 mm）：英國Whatman公司；e.cam duet SPECT 顯像儀：德國Siemens公司。

2 實驗方法

2.1 DOTMP的合成和標記

按照文獻［12］方法確定合成方案，其合成路線示于圖1。以0.5g 1，4，7，10－四氮雜環十二烷為原料，在鹽酸維持強酸性條件下加入亞磷酸和37%甲醛溶液，回流2h，得到粗產物，以丙酮重結晶。

圖1 DOTMP 的合成路線

DOTMP合成和鑒定后，依據文獻［13］的標記條件對DOTMP 進行放射性177Lu 標記。采用放射性色層掃描儀測定標記率。

2.2 177 Lu－DOTMP 在荷瘤小鼠體內的生物分布

2.2.1 小鼠骨轉移癌動物模型的建立

在體外培養細胞株小鼠S180瘤細胞后，用PBS懸浮至3×107／mL，以昆明小鼠為宿主，進行腹水傳代。每只小鼠腹腔注射100μL 瘤細胞，飼養9d后進行傳代培養，三代后可用于皮下肌肉接種實驗。抽取荷S180瘤小鼠腹水，對瘤細胞進行臺盼蘭染色后計活細胞數，用生理鹽水稀釋至107／mL。每只小鼠右后肢股骨旁沿骨膜接種100μL 約106個癌細胞。在SPF 級動物房中常規飼養，觀察腫瘤生長情況，約10d后腫瘤細胞侵蝕入骨，斷頸處死動物，分別取左右雙側腿骨，進行雙側骨組織病理對比分析。

另取25只昆明小鼠，依照上述方法制作荷瘤小鼠，飼養于SPF級動物房，觀察腫瘤生長情況，待腫瘤長至約0.8cm3用于生物分布實驗。

2.2.2177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠體內分布

取25只荷瘤昆明種小鼠，隨機分成5組，每組5只。經尾靜脈注射177Lu－DOTMP 溶 液100μL（約0.22 MBq），分別于注射后1、3、24、48h和6d 處死動物，取血、心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、腫瘤、頭蓋骨和雙側脛骨，稱重并測量其γ計數，計算出單位質量臟器攝取放射性活度占注入總活度的百分率（%ID／g）。

2.3 177Lu－DOTMP在健康兔體內的顯像

取1只健康日本大耳白兔，經耳緣靜脈注射1.0 mL177Lu－DOTMP（約150 MBq），分別于22h和46h顯像，并對比顯像效果。約于顯像前10min，再經耳緣靜脈注射1.5mL 5%巴比妥鈉溶液麻醉動物。選擇能窗113keV 進行顯像，顯像數據在計算機系統256×256 矩陣中進行記錄與分析。每次采集計數為500 000。

3 結果與討論

3.1 DOTMP的合成與分析鑒定

以1，4，7，10－四氮雜環十二烷，亞磷酸和甲醛等為原料，按照文獻［8］的方法合成DOTMP，并經過重結晶得到產物，產率為63%。合成的DOTMP 的紅外光譜中有4 個典型吸收峰：3 138、2 855、1 683、1 455、1 288cm－1。3 138cm－1為羥基伸縮振動峰，2 855cm－1是亞甲基對伸縮振動峰，1 683cm－1為P－O 伸縮振動峰，1 455cm－1是C—P單鍵的伸縮振動，1300～900cm－1區域 是C—N 鍵的伸縮振動，P＝O 等雙鍵的伸縮振動吸收。

DOTMP的1H－NMR 數據（D2O，δ）：3.16～3.20（—N—CH2—PO3H2），3.20～3.50（—N—CH2—CH2—N）。

DOTMP的質譜ESI－MS數據（M—1）相對分子質量為547.2，DOTMP的理論相對分子質量為548.1，說明所合成的產物為目標產物。

本研究采用的合成方法是目前報道中常用的合成方法，以1，4，7，10－四氮環十二烷為母核在四個相同位置引入膦酸亞甲基，所得產率也與文獻報道相似。

在選定的實驗條件下，177Lu－DOTMP 的標記率為99.4%。經生理鹽水稀釋后，用于生物分布實驗或日本大耳白兔顯像研究。

3.2 177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠體內生物分布

3.2.1 動物模型的建立

模型小鼠雙側股骨組織病理切片于光學顯微鏡下觀察，結果示于圖2。

圖2 模型小鼠雙側股骨組織病理

比較圖2左右兩張圖片可以看出，在接種小鼠S180瘤細胞側的腫瘤細胞生長、浸潤成股骨旁肉瘤，瘤細胞已侵及干骺端骨膜組織，腫瘤的主體位于股骨肌肉組織內，但已導致骨組織損傷。病理檢測的結果顯示，模型小鼠符合實驗要求。

3.2.2177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠體內生物分布

177Lu－DOTMP在昆明小鼠體內的生物分布列于表1。表1 結果顯示，177Lu－DOTMP 在血中清除快，在注射1h后為（0.31±0.05）%ID／g，在3h至6d都保持在很低的水平；177Lu－DOTMP在骨中有明顯的放射性攝取，注射1h后已經達到最高值，頭骨和股骨的放射性攝取分別為（18.00±4.68）和（16.67±5.11）%ID／g；注射48h 后，除骨骼外，血和其它主要臟器中都無明顯放射性富集；6d后骨中尚存較高放射性攝取。與正常小鼠體內呈現出相似的代謝趨勢。177Lu－DOTMP在腎中比在其它臟器中攝取高，提示177Lu－DOTMP 主要通過腎臟排泄。荷瘤側的股骨放射性攝取略高于非瘤側股骨，可能與膦酸鹽在體內的吸收途徑相關。177Lu－DOTMP在腫瘤組織中攝取很低，是由于在本研究中腫瘤組織不是靶向器官。DOTMP 能夠定位于骨，是傳遞足夠的放射性劑量進行放射性治療，減輕骨轉移骨痛的基礎。

表1 177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠體內分布（±s，n＝5）

表1 177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠體內分布（±s，n＝5）

3.3 177Lu－DOTMP在健康兔體內的顯像

注射177Lu－DOTMP 22h和46h后，正常日本大耳白兔的SPECT 顯像結果示于圖3。由圖3可以看出：注藥后22h，膀胱有明顯的放射性濃集，說明其主要經泌尿系統排泄；在其他主要器官及軟組織中均未見明顯濃集，說明其在體內的清除速度較快；在骨骼尤其是關節處的攝取高，可以看到全身骨骼輪廓，除膀胱外身體其它組織及器官中都已看不到放射性攝取，體現出177Lu－DOTMP作為骨痛治療藥物良好的體內分布及藥代動力學性質。

圖3 日本大耳白兔177Lu－DOTMP SPECT顯像

4 結論

1）本研究以1，4，7，10－四氮環十二烷為原料合成并純化得到產物DOTMP，產率約為63%。

在選定的實驗條件下，用177Lu標記DOTMP形成的配合物177Lu－DOTMP，標記率＞99.0%。

2）荷瘤鼠體內生物分布結果顯示，177Lu－DOTMP可以選擇性地在骨組織吸收，具有良好的靶向性，而且在血中清除較快，在其他臟器只有少量攝取。

3）正常兔顯像結果顯示，177Lu－DOTMP 在骨中攝取高且滯留時間長。

以上結果提示，177Lu－DOTMP 作為潛在的骨轉移癌疼痛治療藥物，值得進一步研究。

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