發酵藕帶中優良乳酸菌的篩選及生理性能研究

舒麗平，王清章，嚴守雷，李潔

（華中農業大學食品科技學院，武漢，430070）

藕帶（Lotus sprout），學名蓮鞭，又叫藕鞭、藕梁、藕樁子等，是荷的地下莖，橫生于泥中，并不斷分枝蔓延。藕帶一般是在野生蓮藕或子蓮出芽后抽取，以防止地下部分過密（類似疏葉）而影響上部生長從而影響蓮籽產量。藕帶是生長在淤泥中的天然綠色蔬菜，也是春夏餐桌上的美味佳肴。新鮮藕帶脆性較好、風味佳、營養豐富，但在貯藏中極易褐變和變軟，產品外觀、營養價值和風味品質變差[1]。

泡菜是一種傳統的乳酸發酵蔬菜制品，可作為保健食品出售，經常食用可調節腸道微生態平衡、降低膽固醇、提高機體免疫力。蔬菜泡制又是一種古老的冷加工及保藏方法，對蔬菜的營養成分、色、香、味、體的保持都極為有利。

發酵蔬菜的主要菌群——乳酸菌一直是人們研究的熱點。乳酸菌的發酵性能對縮短發酵時間、降低亞硝酸鹽含量、提高泡菜品質和延長泡菜食用期等方面都有重要影響。一般接種發酵所使用的乳酸菌菌種都是從優良的泡菜發酵體系中分離得到的，因為將常用的酸奶等產品的專用菌接種于泡菜，可能存在適應性差，生長繁殖困難，生產出的產品無發酵泡菜獨有的味道等問題。選擇適宜的菌種作發酵劑是得到優良發酵制品的先決條件。因此，根據自身特點研究特定條件下菌種的發酵速度、產酸量、對不同發酵環境的適應能力以及評價其最終的口感與風味對優良菌種的篩選以及確保純接種快速發酵技術的成功至關重要。

本試驗主要從自然泡制藕帶中分離篩選出發酵產酸快、降解亞硝酸鹽能力強、風味好的乳酸菌，并對其進行鑒定和其發酵性能進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

①試驗材料 泡菜原料（藕帶）、泡菜壇、食鹽，均市購。

②主要試劑和儀器設備 MRS肉湯培養基；多價蛋白胨-酵母膏（PY）培養基；氯化鈉；瓊脂；無水乙醇；無水氯化鈣；冰醋酸；鹽酸；亞硝酸鈉；對氨基苯磺酸；鹽酸萘乙二胺；氫氧化鈉；氫氧化鉀；葡萄糖；D-果糖；蔗糖；麥芽糖；乳糖等。

DSX-280型不銹鋼手提式滅菌器；SW-CJ-1FD型超凈工作臺；DNP-9272型電熱恒溫培養箱；722可見分光光度計；Leica DME顯微鏡；Panasonic彩色閉路監控攝像機等。

1.2 試驗方法

①乳酸菌的分離、純化和初步鑒定篩選 藕帶發酵工藝流程如下∶藕帶→清洗、切分護色[2]→漂洗瀝干→5%食鹽水入壇泡制→水封、自然發酵。每隔2～3 d用無菌吸管和消毒器具在無菌操作下取樣，測定泡菜汁的pH值、藕帶的總酸和亞硝酸鹽含量。當酸度達到 0.40%～0.80%或 pH 值 3.20～3.60 時，判斷其發酵成熟[3]。總酸含量按 GB/T 12456-90測定；亞硝酸鹽含量按 GB/T 5009.33-2010測定。

在無菌操作下，對成熟泡菜汁進行梯度稀釋，選取適宜的稀釋度，用混合法倒平板，于自制厭氧裝置中，30℃恒溫培養2 d后，選一定稀釋度的可計數平板，挑取可疑典型特征菌落，進行2～3次劃線純化至單菌落，單菌落經革蘭氏染色鏡檢、過氧化氫酶反應，篩選出G＋，過氧化氫酶試驗陰性的菌株；進一步進行產乳酸定性測定，將乳酸紙層析陽性菌株接種MRS 斜面，4℃下保存備用[3，4]。

乳酸菌檢驗按 GB/T 4789.35-2008操作；產乳酸定性試驗采用乳酸紙層析法[5～8]；測 Rf（比移值）∶將待測菌株的Rf值與標準乳酸的Rf值進行比較，Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。

②乳酸菌的篩選[6，9]分別以產酸速度、亞硝酸鹽降解率、發酵藕帶風味為指標對分離的乳酸菌菌株進行篩選。a.產酸速度。取經活化的菌液以1%的接種量接種于10 mL MRS液體培養基中，30℃培養48 h，每隔12 h測定1次pH 值。

b.亞硝酸鹽降解率。以無菌水代替NaNO2溶液為空白，將產酸速度快的活化菌液以1%的接種量接種到裝有1 mL 1 000 μg/mL NaNO2溶液和 9 mL液體培養基的試管中，另以1 mL NaNO2溶液和9 mL液體培養基的試管為對照，30℃培養72 h。過濾菌體，測定培養基中殘存的亞硝酸鹽含量。

c.接種發酵藕帶風味試驗。接種發酵工藝路線為∶

然后對成熟泡菜進行感官評分[9，10]，感官品嘗小組由3～6人組成。

③篩選菌株的鑒定 a.形態學鑒定。觀察篩選菌株在平板上的菌落特征形態；對菌株進行涂片革蘭氏染色，油鏡下觀察菌體形態。

b.生化特征鑒定。對篩選的優良菌株分別進行16種碳水化合物發酵產酸、過氧化氫酶、硝酸鹽還原、淀粉水解、明膠液化、V-P試驗、硫化氫產生、氨基酸脫羧及精氨酸產氨等試驗[11，12，15～18]。

④菌株生理性能研究[6，9，13]a.生長曲線的測定。將活化后的菌液按10%的比例分別接種到12支MRS液體試管中，30℃培養，每隔2 h取出一支，在600 nm處測定培養液的吸光值（OD值），以相同條件下的空白培養基為對照。

b.菌株最適生長pH值測定。用乳酸或乳酸鈉將MRS液體培養基調至pH 值 1.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0的不同pH值梯度系列，將培養到對數生長期的菌液以1%的接種量接種于其中，30℃培養48 h后測定其吸光值，以相同條件下的空白培養基作對照。

c.菌株鹽濃度適應性試驗。用NaCl將MRS液體培養基調至0%、2%、4%、6%、8%、10%的不同鹽濃度梯度系列，把培養到對數生長期的菌液以1%的接種量接種于其中，30℃培養48 h后測定其吸光值，以相同條件下的空白培養基作對照。

d.菌株最適生長溫度測定。把培養到對數生長期的菌液以1%的接種量接入MRS液體管中，分別在4、15、20、30、37、45℃培養，以同溫下不接種的空白培養基作對照，48 h后測定其吸光值。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離、純化和初步鑒定篩選

從成熟泡菜汁中初步分離純化得到22株具有可疑典型特征菌落的菌株。單菌落經革蘭氏染色鏡檢、接觸酶反應，篩選出9株均為G＋，接觸酶陰性的菌株，編號為 L1～L9。

在層析濾紙上，底版呈藍色而有機酸呈黃色斑點。被測9株菌株斑點的Rf值與標準乳酸斑點的Rf值比較，相對誤差都小于 1%（表1），可判斷為乳酸[5，8]。

2.2 乳酸菌的篩選

通過發酵產酸和降解亞硝酸鹽試驗以及發酵藕帶感官評定，依次對L1～L9進行篩選。

①發酵產酸速度 根據9株菌株產酸結果，篩選出 L1、L2、L3、L5、L6、L8、L9共 7 株產酸速度較快的菌株，在36～48 h內，使培養液的pH值均降到3.60以下，適合純種發酵泡菜，發酵前期（24 h）產酸較快，后期由于高酸的抑制作用發酵速度減慢[14]。L4和L7產酸較慢，48 h后pH值均大于3.60。

②降解亞硝酸鹽能力 從7株產酸速度較快的乳酸菌菌株中得到5株亞硝酸鹽降解能力較強的菌 株 L1、L3、L6、L8、L9，其亞硝酸鹽降解率分別為73.73% 、89.65% 、97.40% 、91.78% 、79.69%，其余兩株菌對亞硝酸鹽降解能力較小。

表1 乳酸定性試驗結果（發酵液的Rf值）

③接種發酵藕帶感官評價 將5株亞硝酸鹽降解能力強的菌株對接種藕帶發酵，篩選出發酵風味好的優良菌株。

本試驗中泡菜制作過程未添加任何佐料，風味來源僅為原料本身具有和發酵劑作用產生。對成熟泡菜進行感官評分見表2，最終篩選出L3和L6兩株優良菌株。這兩菌株純種發酵藕帶時，接近自然發酵的總體口味。

表2 藕帶泡菜感官評定結果（平均值±標準偏差）

圖1 L3（左）和 L6（右）菌株的光學顯微鏡觀察（×1 000）

2.3 篩選菌株的鑒定

篩選出的L3和L6菌株經形態特征鑒定（圖1），可初步確定為乳酸菌。對L3和L6進行碳水化合物發酵試驗（表3）和生化試驗（表4），并對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，判定L3為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum簡寫為 LP），L6為短乳桿菌（Lactobacillus brevis簡寫為Lb），均來自成熟藕帶泡菜汁，是發酵中后期的主導菌。

表3 兩株菌株的碳水化合物發酵試驗結果

2.4 菌株生理性能研究

①菌株的生長曲線 由圖2可以看出，兩株菌的生長周期較短，起始生長速度快，培養4 h后就進入對數生長期，12～16 h后即進入穩定期，以后生長趨于平緩。

②菌株生長的最適pH值 由圖3可以看出，菌株生長的最適pH值均為 5.0～6.0。相對來說，短乳桿菌有較強的耐酸性，在pH值3.0的環境中仍可生長良好，而植物乳桿菌生長很慢，兩株菌株對堿的耐受能力都較差，短乳桿菌在 pH值大于8.0時生長受到抑制，而植物乳桿菌耐堿能力較強，pH值大于9.0仍能一定程度存活。

③菌株的耐鹽性 圖4顯示，兩菌株對鹽均有較好的耐受能力，在含鹽量6%時仍能正常生長。隨著鹽濃度的升高，生長受到抑制，且植物乳桿菌較短乳桿菌耐鹽能力強，能在8%的鹽濃度中生長，而后者生長緩慢，但鹽濃度大于10%以后，兩株菌均基本不生長。

表4 兩株菌株的生化試驗結果

圖2 菌株的生長曲線

圖3 不同pH值下菌株的生長情況

圖4 鹽濃度對菌株生長的影響

圖5 不同培養溫度下菌株的生長情況

④菌株生長的最適溫度 由圖5可知，兩菌株的生長溫度范圍（20～37℃）較寬，且生長良好，最適生長溫度均為30℃左右，它們在15℃時也能緩慢生長。

3 結論

①從自然泡制藕帶水中分離篩選出兩株發酵藕帶產酸能力強、亞硝酸鹽含量低、風味好的乳酸菌菌株，生理生化鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plan-tarum）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

②兩株菌株最適生長 pH 值范圍均在 5.0～6.0，短乳桿菌在pH值3.0時生長良好，pH值大于8.0時生長受到抑制，植物乳桿菌在pH值3.0時生長很慢，而pH值大于9.0時仍能一定程度存活；在鹽濃度低于6%時兩菌株均能正常生長，10%含鹽量抑制其生長，植物乳桿菌能耐8%的鹽濃度；兩株菌株生長溫度范圍較寬（20～37℃），最適生長溫度均為 30℃，在15℃時也能緩慢生長。在MRS液體培養基中，兩株菌株對初始濃度為100 μg/mL的亞硝酸鹽的降解率分別為 89.65%和 97.40%。

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