甲磺酸酚妥拉明抗心律失常的初步研究

許 菲

（蚌埠市第三人民醫(yī)院，安徽 蚌埠 233000）

心律失常為心血管病中的常見(jiàn)疾病，包括慢性心律失常和快速性心律失常。目前，很多治療心律失常藥物的作用機(jī)制是通過(guò)影響心肌細(xì)胞膜上各種離子通道的活性狀態(tài)而實(shí)現(xiàn)的［1，2］。有文獻(xiàn)報(bào)道［3，4］，α腎上腺素受體激動(dòng)劑有可能導(dǎo)致心律失常，而作為α腎上腺素受體阻斷劑的甲磺酸酚妥拉明（Phentolamine Mesylate，PM）或許會(huì)抑制此作用，故本實(shí)驗(yàn)采用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)研究PM對(duì)正常大鼠心室肌細(xì)胞膜鈉離子通道電流的影響［5，6］，進(jìn)而了解PM是否有抗心律失常作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

選取體質(zhì)量為200～250g的9～10周齡的SD大鼠（雌雄不限），由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試藥和儀器

實(shí)驗(yàn)藥物：PM購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。試劑：膠原酶Ⅰ型，購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)：No232－582－9。儀器：倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；膜片鉗放大器（EPC－9，德國(guó)）；微電極拉制器（NARISHIGE，日本）；液壓微電極推進(jìn)器（NARISHIGE，日本）；顯微鏡攝像機(jī)（日本JVC公司）；模數(shù)／數(shù)模轉(zhuǎn)化器（Digitata1200A／B，美國(guó)AXON公司）；恒溫水浴箱（DR－HW－1型，北京）；心肌細(xì)胞封接監(jiān)視器（SONY SSN，日本）；記錄分析軟件（Patch Clamp 6.01，美國(guó)AXON公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞分離

單個(gè)心室肌細(xì)胞是采用酶解的方法進(jìn)行分離。用苯巴比妥鈉（30mg／kg i.p）麻醉后，立即開(kāi)胸取出心臟，置于2℃的無(wú)Ca2＋臺(tái)氏液中，心臟經(jīng)修飾后固定在Langendorff灌流架上，用無(wú)Ca2＋臺(tái)式液經(jīng)主動(dòng)脈根部逆灌流5min，用含膠原酶I及0.2%牛血清蛋白的無(wú)Ca2＋臺(tái)氏液反復(fù)灌流12 min，至心臟膨大出現(xiàn)拉絲后從灌流裝置上取下，剪成小塊，吸管反復(fù)吹打，最后吸取上清液保存在KB液中備用。

2.2 細(xì)胞封接與全細(xì)胞記錄模式的形成

取上述保存的心室肌細(xì)胞上層懸液數(shù)滴，滴于細(xì)胞池中，選取表面光潔、橫紋清晰的心肌細(xì)胞為研究對(duì)象。使用液壓微操縱器將電極靠近細(xì)胞進(jìn)行封接，吸破細(xì)胞膜，補(bǔ)償電容電流和電極串聯(lián)電阻，形成全細(xì)胞記錄模式。在使用10－5mmol／L PM干預(yù)前（對(duì)照）和干預(yù)后分別記錄INa激活（電流－電壓）、穩(wěn)態(tài)失活、失活后再恢復(fù)刺激程序下的電流。實(shí)驗(yàn)中脈沖信號(hào)由Patch Clamp 6.01軟件控制，通道信號(hào)經(jīng)EPC－9膜片鉗放大器放大，通過(guò)Ag－AgCl電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導(dǎo)入細(xì)胞，產(chǎn)生的電流信號(hào)經(jīng)EPC－9轉(zhuǎn)換，為Patch Clamp 6.01軟件收集和分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由計(jì)算機(jī)通過(guò)Patch Clamp 6.01軟件控制采集數(shù)據(jù)，用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均用（）表示，P＜0.05提示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 INa電流的記錄

3.1 INa電流－電壓曲線(xiàn)（I－V曲線(xiàn)）

維持電位在－80mV，階躍＋10mV，逐步去極化至＋50mV，刺激頻率1Hz，鉗制時(shí)間60ms。為了消除細(xì)胞間因體積差異而造成的誤差，電流值以電流密度（pA／pF）表示，將不同鉗制電壓下的INa電流密度繪成I－V曲線(xiàn)。觀察10－5mmol／L PM干預(yù)組對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa I－V曲線(xiàn)的影響。結(jié)果如圖1所示，兩組細(xì)胞INa的I－V曲線(xiàn)，在近－70mV激活，－40mV達(dá)峰值，＋50mV時(shí)反轉(zhuǎn)。PM干預(yù)組與對(duì)照組相比，I－V曲線(xiàn)明顯上移，且對(duì)照組和10－5mmol／L PM干預(yù)組的INa電流密度峰值分別為（－39.87±1.28）pA／pF（n＝8）和（－17.31±0.33）pA／pF（n＝8），PM 干預(yù)組較對(duì)照組INa電流密度峰值明顯下降（P＜0.05）。但I(xiàn)Na的電壓依賴(lài)性趨勢(shì)未發(fā)生改變，其反轉(zhuǎn)電位、峰值電位、激活電位及I－V曲線(xiàn)的形態(tài)軌跡無(wú)明顯影響。

圖1 10－5mmol／L PM干預(yù)組和對(duì)照組的I－V曲線(xiàn)

3.2 INa穩(wěn)態(tài)失活曲線(xiàn)

維持電位＝－80mV，條件脈沖－160mV～－50mV，鉗制時(shí)間100ms，階躍＋10mV，每次條件脈沖后緊跟一固定的去極化到－40mV的測(cè)試脈沖，持續(xù)時(shí)間25ms，以INa與最大激活時(shí)的INa的比值與對(duì)應(yīng)條件脈沖膜電位作圖得到鈉通道失活曲線(xiàn)。觀察10－5mmol／L PM干預(yù)組與對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa電壓依賴(lài)性穩(wěn)態(tài)失活曲線(xiàn)的變化。結(jié)果如圖2所示，PM干預(yù)組與對(duì)照組相比，INa電壓依賴(lài)性穩(wěn)態(tài)失活曲線(xiàn)明顯向超極化方向移動(dòng)。

3.3 INa失活后再恢復(fù)曲線(xiàn)

采用雙脈沖刺激法，第一個(gè)脈沖維持電位為－80mV，去極化至－30mV，持續(xù)50ms，在第1個(gè)脈沖回到維持電位后給予第2個(gè)脈沖去極化至－40mV，持續(xù)30ms，第1個(gè)脈沖和第2個(gè)脈沖間隔時(shí)間依次是10ms、20ms、30ms，逐級(jí)遞增至150ms。第1個(gè)脈沖和第2個(gè)脈沖的INa之比與相應(yīng)的間隔時(shí)間作圖，得鈉通道失活后再恢復(fù)過(guò)程曲線(xiàn)。觀察PM對(duì)失活后再恢復(fù)過(guò)程的影響。由圖3可知，PM干預(yù)組INa失活后再恢復(fù)明顯減慢，再恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)。

圖2 10－5mmol／L PM干預(yù)組和對(duì)照組的INa穩(wěn)態(tài)失活曲線(xiàn)

圖3 10－5mmol／L PM干預(yù)組和對(duì)照組的INa失活后再恢復(fù)曲線(xiàn)

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PM能降低正常心室肌細(xì)胞INa電流密度峰值，能使INa通道失活加速，失活后再恢復(fù)時(shí)間延遲；這些現(xiàn)象表明PM可以使心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位0相上升速率減慢，使心肌細(xì)胞間傳導(dǎo)減慢，心肌細(xì)胞的興奮性降低，使折返激動(dòng)不易形成，從而可以降低快速性室性心律失常的發(fā)生率。

［1］ 戴德哉.嚴(yán)重心律失常的相關(guān)離子通道病及分子機(jī)制探討［J］.生命科學(xué)，2008，20（1）：69－72.

［2］ 潘建紅，姚民強(qiáng)，王佩顯.原發(fā)性心電疾病的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)心血管雜志，2010，15（5）：403－405.

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［6］ 巫少榮，李自成，余健，等.大蒜素對(duì)心肌室細(xì)胞膜鈉通道電流的影響［J］.中國(guó)病理學(xué)雜志，2011，27（4）：658－661.