石見穿多糖抑制人胃癌細胞系MGC-803細胞遷移及其機制的初步研究

朱紅巖 孫玉國 曲杰 卞永生 .承德醫學院，河北承德 067000；.承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000；3.河北省保定市第一醫院，河北保定 07000

石見穿多糖抑制人胃癌細胞系MGC-803細胞遷移及其機制的初步研究

朱紅巖1孫玉國1曲杰2卞永生3▲1.承德醫學院，河北承德 067000；2.承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000；3.河北省保定市第一醫院，河北保定 071000

目的觀察石見穿多糖對人胃癌細胞系MGC-803細胞遷移能力的影響，并探討其作用機制。方法利用水萃取法制備石見穿多糖，通過劃痕實驗、Transwell實驗觀察不同濃度對石見穿多糖同樣條件培養下胃癌MGC-803細胞遷移能力的影響，并采用Western blot方法檢測不同濃度石見穿多糖對MGC-803細胞內白介素8（IL-8）蛋白表達水平的影響。結果同未加藥物對照組相比，經高濃度石見穿多糖（50、100 g/L）處理后，MG-63細胞的劃痕愈合能力明顯減弱，穿膜細胞的數量顯著減少；同時，細胞內IL-8蛋白的表達水平明顯降低，并與石見穿多糖的濃度有關。結論石見穿多糖抑制了胃癌MGC-803細胞的遷移能力，其作用與抑制MGC-803細胞內的IL-8蛋白表達水平有關。

石見穿多糖；MGC-803細胞；白介素8；遷移

石見穿為唇形科植物華鼠尾Salvia chinensis Benth.的全草，味苦、辛，性平，具有清熱解毒、活血鎮痛的功能。臨床上多用于治療黃疸型肝炎、癌癥、腎炎、痛經等[1]。動物實驗證明，石見穿能抑制或殺滅癌細胞，使患病小白鼠生存期顯著延長，能增強實驗動物的免疫功能[2]。到目前為止，從石見穿全草中分離出的包括多糖類、三萜類、甾醇類、多酚類等化學成分已達33種之多[3]，其中石見穿多糖（Salvia chinensis Benth.Polysaccharides，SBP）是石見穿的重要活性成分之一，具有調節免疫、抗氧化、抗腫瘤的功能[4]。近年來對石見穿多糖抗腫瘤作用的研究主要是其抑制腫瘤的增殖[5-6]，關于其抑制腫瘤細胞遷移功能的研究報道較少。本研究旨在觀察石見穿多糖對人胃癌細胞系MGC-803細胞體外遷移能力的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株人胃癌MGC-803細胞，由承德醫學院附屬醫院中心實驗室提供。

1.1.2 藥物石見穿藥材購自河北安國市藥材市場，由承德醫學院趙春穎副研究員鑒定為為唇形科鼠尾草植物紫參Salvia chinensis Benth.的全草，樣品保留在承德醫學院中藥研究所。

1.1.3 試劑RPMIMedium1640培養基干粉和胎牛血清（FBs）購自GIBCO公司，胰蛋白酶購自Amersco公司產品，IL-8及β-actin抗體購自Sigma公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋公司。

1.1.4 儀器Primo R型低溫高速離心機（德國Heraeus公司），CO2培養箱（美國Forma公司），倒置熒光顯微鏡（Zeiss公司），HFsafe-1500型生物安全柜（HEAL FORCE公司），Transwell小皿（Millipore公司），3633型高壓消毒鍋（美國Yamato scientificwc公司），HP-8453紫外-可見分光光度計（惠普公司），梅特勒-托利多AG245電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養將MG-XX細胞置于37℃、5%CO2的培養箱中，用含10%胎牛血清以及青、鏈霉素各100 U/mL的RPM1640培養液培養。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 石見穿多糖制備根據文獻[7]，稱取適量石見穿。用石油醚于索氏提取器回流5 h，脫去葉綠素等脂類。按水浴溫度90℃，料液比為1∶10，提取時間2.5 h，提取4次作為提取工藝，進行回流浸提，冷卻后過濾，合并上清液，濃縮后加入無水乙醇，使濃度達到80%得沉淀。沉淀用Savage法去除蛋白5次，再依次用無水乙醇、丙酮反復洗滌，減壓干燥得黑色粗多糖粉末。

1.2.3 細胞形態學觀察將MGC-803懸液接種于6孔培養板，每孔1mL，分別加入100μL不同濃度（100、50、25、12.5 g/L）的石見穿多糖溶液及等量PBS作為對照，常規培養。培養24 h后于倒置相差顯微鏡下直接觀察培養板中腫瘤細胞形態特征。所有濃度下的培養均重復3次，以典型結果作為最終數據。

1.2.4 細胞劃痕實驗將MGC-803細胞鋪滿6孔培養板，待細胞貼壁長滿后進行劃痕，PBS洗一遍，更換為無血清培養基，分別在0 h和24 h后觀察劃痕距離并拍照。

1.2.5 Tr answe l l實驗取指數生長期的MGC-803細胞，胰酶消化，RPM1640培養基制備細胞懸液，進行細胞計數。調整細胞數為每100μL懸液含5×104個細胞進行鋪板。24孔培養板中每孔加入600μL含15%小牛血清的RPM1640完全培養基，在Transwell小室的上室分別加入100μLMGC-803細胞懸液，各含5×104個細胞，最后上室加入10μL 1% BSA，使BSA最終濃度為0.1%，以保持上室內的滲透壓。加入不同濃度的石見穿多糖100μL，37℃、5%CO2培養箱常規培養15 h。取出小室用90%乙醇固定，0.1%結晶紫溶液染色，置于顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取4個低倍視野（×400）進行細胞計數，并計算平均值。實驗重復3次。

1.2.6 Wes t e r n b l o t實驗分別取石見穿多糖處理前后的MGC-803細胞均約5×106個，加入300μL細胞裂解液，冰上裂解30min后轉移至1.5mL EP管中，12 000 r/min 4℃離心4min，取上清液置于-20℃保存。BCA法測定蛋白濃度。每個泳道上樣蛋白量為40μg，上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE電泳），80V電泳30 min，120 V電泳90 min，電泳完畢后，將蛋白轉移至PVDF膜，用新鮮配制的含5%脫脂奶粉的PBST液搖床上封閉2 h，加入IL-8抗體（1∶500）及抗β-Actin抗體（1∶500），4℃反應過夜。然后將膜取出，用PBST液洗滌3次，每次15 min，辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶3 000）室溫封閉1 h，然后用PBST液洗滌3次，每次10 min，最后用化學發光法檢測，X線片記錄結果。實驗重復3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行數據處理，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤細胞形態學變化

正常培養條件下生長的MGC-803細胞形態規則，輪廓清晰，胞體透亮，貼壁良好；而以50 g/L和100 g/L石見穿多糖處理后，腫瘤細胞生長緩慢，胞體皺縮，部分細胞破碎，總體呈分散懸浮生長，貼壁現象減弱甚至消失。當使用較低濃度石見穿多糖處理MGC-803細胞時，其生長表型同正常細胞沒有明顯變化。見圖1。

2.2 劃痕實驗

劃痕實驗中通過劃痕愈合程度的比較可以判斷石見穿多糖對MGC-803細胞遷移能力的影響情況。相同條件培養24 h后，未經石見穿多糖處理的MGC-803細胞運動遷移基本完全覆蓋了劃痕區域。相反的，加入石見穿多糖以后，MGC-803細胞的遷移能力明顯減弱，細胞間劃痕的距離縮短趨勢減緩，并且石見穿多糖濃度越高MGC-803細胞的遷移受阻越明顯。方差分析結果顯示，石見穿多糖處理組在作用24 h與未加藥物的對照組（石見穿多糖濃度為0）比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 Transwell實驗

相較于未進行藥物處理的MGC-803細胞，不同濃度的石見穿多糖處理后穿膜細胞的數量均減少，且呈現濃度相關性。結果采用方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 W estern blot實驗

已有證據表明細胞因子IL-8參與腫瘤細胞的遷移過程，本研究通過Western blot對石見穿多糖處理的人胃癌MGC-803細胞中IL-8蛋白水平的變化進行了檢測。結果顯示，經石見穿多糖處理過的MGC-803細胞中IL-8蛋白表達水平較對照組明顯降低，其蛋白總量隨著石見穿多糖濃度的增加而減少。見圖2。

表1 不同濃度的石見穿多糖對人胃癌MGC-803細胞遷移能力的影響

表2 不同濃度的石見穿多糖對人胃癌MGC-803細胞穿膜能力的影響

3 討論

研究表明，胃癌細胞的轉移過程伴隨著多種細胞因子的異常表達[8]。細胞因子是由多種細胞產生，具有廣泛調節功能的多肽分子，參與調控細胞的增殖分化及細胞間的相互作用[9]。根據產生細胞種類和功能的不同，細胞因子可分為多種，且腫瘤細胞亦可合成或分泌其中部分種類的細胞因子[10]。

IL-8是1987年Yoshimur發現的第一個趨化因子，它通過激活和趨化嗜中性粒細胞，在多種炎癥反應中發揮作用[11]。近年研究發現，IL-8與腫瘤組織密切相關，在支氣管原位癌、肺癌、肝癌等腫瘤組織中均檢測到IL-8mRNA及蛋白表達。已有實驗及臨床數據顯示，正常胃黏膜→癌前狀態→胃癌的發生過程中IL-8蛋白陽性表達率逐漸升高[12]。有學者通過體外實驗發現：IL-8促進肝癌細胞、結腸癌細胞、胰腺癌細胞等細胞的遷移、侵襲力[13-15]。

我國是天然藥物大國，應用中草藥治療腫瘤歷史悠久，許多中藥材因具有抗腫瘤作用被深入研究[16-18]。現代藥理研究表明，石見穿具有抗腫瘤效果，常與其他藥物配合使用，應用于肝癌、直腸癌及婦科腫瘤的治療。石見穿全草水提取物主要成分為石見穿多糖，有多種生理活性，如抗菌、抗炎及抗腫瘤等[4]。然而，對其抗腫瘤機制方面的研究較少，本研究中，筆者以人胃癌MGC-803細胞為評價體系，初步研究石見穿多糖對人胃癌細胞轉移能力的影響，并對其中的相關機制作出了初步揭示。

本研究結果顯示，石見穿多糖對人胃癌MGC-803細胞的遷移有明顯的抑制作用，且其與用藥濃度呈正向相關。同時，遷移能力減弱細胞中細胞因子IL-8的表達被強烈抑制。據此，筆者推測石見穿多糖抑制人胃癌MGC-803細胞的遷移與其抑制細胞內IL-8蛋白表達水平有關，這也符合已有的研究結果。關于石見穿多糖的化學結構與人胃癌MGC-803細胞核酸構成和蛋白質空間結構的改變正在進一步研究。

[1]謝宗萬.石打穿與石見穿的品種考證[J].中國中藥雜志，2000，25（1）：49-50.

[2]金長娟.七葉靈對Lewis肺癌細胞荷瘤小鼠作用的初步觀察[J].上海中醫藥大學學報2002，16（2）：54-55.

[3]徐敬宣，薛姣，錢曉萍，等.石見穿的化學成分及抗腫瘤作用研究進展[J].現代腫瘤醫學，2011，19（3）：587-590.

[4]Kumazawa Y，Mizunoe K，Otsuka Y.Immunostimulating polysaccharide separated from hot water extrad of angelica acutiloba[J].Kitagawa（Yamato Tohki），1982，47（1）：75-83.

[5]韋金育，李延，韋濤，等.50種廣西常用中草藥、壯藥抗腫瘤作用的篩選研究[J].廣西中醫學院學報，2003，6（4）：3-7.

[6]Shoemaker M，Hamilton B，Schanaz H，et al.In vitro anticancer activity of twelve Chinesemedicinal herbs[J].Phytotherapy Research，2005，19（7）：649-651.

[7]徐偉，鄭海音，鄭曉燕，等.石見穿多糖的含量測定及組分分析[J].福建中醫學院學報，2008，18（1）：20-22.

[8]張筱茵，陳詠儀，劉泳，等.胃癌局部細胞因子表達譜分析[J].中華腫瘤雜志，2002，24（1）：14-16.

[9]Kokkas A，Goulas A，Stavrianos C，et al.The role of cytokines in pulp inflammation[J].JBiol Regul Homeost Agents，2011，25（3）：303.

[10]Martin FH，Suggs SV，Langley KE，et al.Primary structure and functional expression of rat and human stem cell factor DNAs[J].Cell，1990，63（1）：203.

[11]Yoshimura T，Metsushima K，Penheim JJ.Neutrophil chemotactic factor produced by lipopolysacchmide（LPS）-stimulatedhuman blood mononuclear leukocytes：Partial characteri-zation and separation fiom interleu-kinl（IL-l）[J].JImmunol，1987，139（3）：788-793.

[12]付浩，袁媛.IL-8基因在胃癌及癌前狀態中的表達[J].中國腫瘤臨床，2002，29（4）：237-240.

[13]Kubo F，Ueno S，Hiwatashi K，et al.Interleukin 8 in human hepatocellular carcinoma orrelates with cancer cell invasion of vessels but not with tumor angiogenesis[J].Ann Surg Oncol，2005，12（10）：800-807.

[14]Matsuo Y，Ochi N，Sawai H，et al.CXCL8/IL-8 and CXCL12/SDF-1alpha co-operatively promote invasiveness and angiogenesis in pancreatic cancer[J].Int JCancer，2009，124（4）：853-861.

[15]Ning Y，Manegold PC，Hong YK，et al.Interleukin-8 is associated with proliferation，migration，angiogenesis and chemosensitivity in vitro and in vivo in colon cancer cell linemodels[J].Int JCancer，2011，128（9）：2038-2049.

[16]趙冬耕，孫佳，王明艷，等.抗癌扶正方對人肝癌細胞SMMC-7721PI3K/ AKT信號通路的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（11）：136-139.

[17]梁勇，廖穎，張宏，等.黑骨藤的抗腫瘤活性成分[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（15）：119-122.

[18]馮承恩，田素英.金櫻根多糖的制備及其體內抗腫瘤作用初探[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（6）：209-212.

Effect of the Salvia chinensis Benth.Polysaccharides on themetastasis ability of human gastric cancer cells(MGC-803 cells)

ZHU Hongyan1 SUN Yuguo1 QU Jie2 BIAN Yongsheng3▲
1.Chengde Medical University，Hebei Province，Chengde 067000，China;2.The Affiliated Hospital of Chengde Medical University，Hebei Province，Chengde 067000，China;3.The First People′s Hospital of Baoding City，Hebei Province，Baoding 071000，China

ObjectiveTo investigate theeffectof Salvia chinensis Benth.Polysaccharides(SBP)on themetastasisability ofhuman gastric cancer cell line(MGC-803 cells)in vitro,and to explore the action mechanisms of SBP.MethodsSBP prepared by extraction ofwater,the effect of the different concentration of SBP on the experimentalmetastasis ability of MGC-803 cellswas observed by scratch test and Transwellmetastasis experiments.The level of IL-8 protein in MGC-803 cells were detected by Western Blotting.ResultsCompared with control group(no drug),SBP(50 and 100 g/L)inhibited the MGC-803 cells wound,MG-63 cells scratches healed was significantly weakened,number of cells passing through filter membrane would decrease.The level of IL-8 protein in MG-63 cells decreased significantly after treated with SBP and correlation with the concentration of SBP.ConclusionSBP ia able to inhibit themetastasis ability of MGC-803 cells.The actionmechanisms of SBP are related to the inhibition of IL-8 protein levels in MGC-803 cells.

Salvia chinensis Benth.Polysaccharides;MGC-803 cells;IL-8;Metastasis

R730.52

A

1673-7210（2012）11（b）-0005-03

朱紅巖（1987-），男，承德醫學院2010級在讀碩士研究生，從事腫瘤細胞增殖和遷移方面的研究。

▲通訊作者

2012-06-12 本文編輯：谷俊英）