芒果皮提取物的體外清除自由基作用研究＊

周榮光，楊兆祥，王 金，何凌宇，普俊學

（1.昆明制藥集團股份有限公司藥物研究院，云南 昆明650100；2.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明650224；3.云南中醫學院中藥學院，云南 昆明650500）

芒果系漆樹科芒果屬植物芒果（Mangif er a indical L.）的成熟果實，主產于熱帶、亞熱帶，是世界第二大熱帶水果，被譽為“熱帶水果之王”。在我國，芒果主要分布在云南（東南部）、貴州（南部）和廣西（南部）三省，多為家養栽培，為當地的重要經濟作物。研究表明，芒果果皮含有大量的黃酮［1］、山酮［1］、多糖［2］以及種類眾多的小分子多酚類物質［3］，具有止咳化痰［4］、抗炎［4］、抑 菌［5］、抗 氧 化［6］等 作 用。目 前，芒 果 除 鮮 食外，主要被加工成飲料、罐頭、果凍等，加工過程中產生的約占鮮果重量5%～10%的芒果皮則被拋棄，不僅浪費資源，而且污染環境。因此，如何利用廢棄的芒果皮資源，進行開發利用，變廢為寶，具有十分重要的意義。本文對芒果皮的水提取物、乙醇提取物和石油醚提取物的清除自由基活性進行研究，為芒果皮的科學開發利用提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 試劑與儀器 AB204－N型電子天平（瑞士 Mettler公司）；Shi madzu UV2401PC紫外可見分光光度儀（日本島津公司）；HH－4數顯恒溫水浴鍋（天津市恒溫水浴鍋廠）；LD－500刀片式粉碎機（長沙市岳麓區常宏制藥機械設備廠）；PGX－330 A－12 H光照箱（寧波萊福科技有限公司）。核黃素（VB2）、氯化硝基四氮唑蘭（NBT），番紅花紅（Safranine T），蛋氨酸，2，2－二苯基－1－苦肼基（DPPH）購自Sig ma－Aldrich公司。乙醇、石油醚、二甲基亞砜（DMSO）為化學純，購自昆明汕滇精細化學品有限公司；其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 藥材 芒果，購自昆明水果市場。

2 實驗方法

2.1 芒果皮提取物的制備 取新鮮成熟芒果，自來水洗凈，晾干，用水果刀均勻削取果皮，果皮厚度約1～5 mm。果皮置陽光下曬干，用刀片式粉碎機粉碎至20 mm以下。稱取粉碎后的芒果皮3份，50 g／份，分別加入水、95%乙醇和石油醚500 mL，加熱回流提取2 h，重復提取3次，提取液趁熱過濾，過濾液合并，減壓濃縮為浸膏，冷凍干燥，分別得到水提取物（EW）9.5 g，95%乙醇提取物（EEt）7.3 g和石油醚提取物（EP）3.8 g。取上述芒果皮的水提取物、95%乙醇提取物和石油醚提取物適量，以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，配制不同濃度的待測溶液，備用。

從“有計劃的商品經濟”到“社會主義市場經濟”，從“民主法制”到“依法治國”，從“精神文明”到“文化強國”，從調整社會關系到構建“和諧社會”，從植樹造林到“生態文明”，從“一國兩制”到香港、澳門回歸，從“革命與戰爭”到“和平與發展”，神州大地處處涌動著改革的大潮，開放的窗口迎接著八面來風。

產生的羥自由基（·OH）與指示劑發生反應，當體系中存在自由基清除劑時，清除劑與羥自由基作用，使羥自由基對指示劑的作用降低，通過檢測指示劑的變化情況，即可獲得清除劑對羥自由基的清除能力。根據所用指示劑，通常采用的方法有鄰二氮菲法和亞甲基藍（MB）法等。但這些方法多適用于測定單純的有機物的活性，不適用于組分復雜的提取物的羥自由基活性的測定。本文采用Fenton反應產生羥自由基使番紅花紅褪色的方法來測定芒果皮提取物清除羥自由基的活性，該方法具有抗干擾能力強，重現性好，穩定可靠的特點。

說明低磷環境抑制了苦蕎根系生長，不耐低磷苦蕎受影響更嚴重。同時，各苦蕎幼苗莖葉干重的變化大于根系干重，這是根冠比值上升的主要原因。與正常供磷濃度(P1)相比，P2濃度下，除‘KQ10-11’外，其它基因型苦蕎根冠比均有升高；P3濃度下，各基因型苦蕎根冠比顯著升高，而‘KQ10-11’的根冠比卻顯著降低。說明不耐低磷苦蕎品種‘KQ10-11’的根系對低磷脅迫更敏感，受低磷脅迫影響程度更大。

芒果皮的95%乙醇提取物（EEt）和水提取物（EW）對超氧陰離子自由基的清除作用顯著強于石油醚提取物（EP）。3種提取物對超氧陰離子的清除作用與樣品濃度呈一定的線性關系，EP線性方程為y＝0.416 8x＋5.164 3，R2＝0.943 5，IC50＝107.57μg／mL；EW 線性方程為y＝0.7855x＋5.267 9，R2＝0.956 4，IC50＝56.95μg／mL；EEt在0～80μg／mL范圍內呈現良好的線性，y＝1.099 5x＋3.64，R2＝0.987 3，IC50＝42.16μg／mL，當樣品濃度≥80μg／mL，清除率隨濃度的變化趨緩。見圖2。

3 實驗結果與討論

3.1 對DPPH自由基的清除作用 DPPH在有機溶劑中是一種穩定的自由基，其乙醇溶液顯深紫色，在517 n m處有強吸收。當與抗自由基活性物質作用時，其孤對電子被配對，因而吸收消失或減弱，通過測定吸收減弱的程度，可評價自由基清除劑的活性。

2.3 超氧陰離子自由基清除能力測定 采用光照核黃素方法［8］。用p H 7.4的PSB緩沖液為溶劑，配制1.67×10～5 mol·L－1核黃素，0.01 mol·L－1蛋氨酸，4.6×10～5 mol·L－1氯化硝基四氮唑蘭（NBT）。分別取上述3種溶液各2.0 mL，加入1.2.1中不同濃度的待測試樣溶液1.0 mL，置光照箱中于4 500 lx下光照30 min，用紫外－可見分光光度計于560 nm處測定吸光度值As；同法，以1.0 mL DMSO代替樣品溶液，測定吸光度值A0。用p H 7.4的PSB緩沖溶液6.0 mL＋DMSO 1.0 mL作參比溶液。取3次測試平均值，按下式計算清除率：

借鑒歐盟水框架分類分項建立標準的方法，建立北京山區河溪生態評價體系（表2）。基于北京地區的研究水平和對實際生產實踐的指導需求，本體系生物要素中的要素項暫時不包含魚類，各要素項生態質量均分為4級；對水文地貌和物理化學兩大要素類不分要素項，生態質量均分為5級。根據該分級體系和標準，針對各要素類或要素項分別評定生態質量等級。

圖1 不同濃度下提取物對DPPH自由基的清除率

3.3 對羥自由基的清除作用 石油醚提取物（EP）線性方程y＝17.1x＋1.689 3，R2＝0.966 2，IC50＝2.83 mg／mL；水提取物（EW）在0～1.25 mg／mL范圍內呈現良好的線性，y＝51.669x＋4.490 5，R2＝0.981 6，IC50＝0.88 mg／mL，當樣品濃度≥1.25 mg／mL，清除率隨濃度的變化趨緩；95%乙醇提取物（EEt）在 0～1.00 mg／mL 范圍內線性方程為 y＝84.52x＋9.08，R2＝0.935 5，IC50＝0.484 mg／mL，當樣品濃度≥1.00 mg／mL，清除率隨濃度的變化明顯趨緩。對羥自由基的清除能力大小為EEt＞EW＞EP。見圖3。

2.4 羥自由基清除能力測定 采用Fenton反應產生羥自由基使番紅花紅褪色的方法［9］。取p H 7.4的PSB緩沖溶液1.0mL，40μg／mL番紅花紅1.0 mL，0.945 mmol·L－1EDTA－Fe（Ⅱ）（新鮮配制）1.0 mL，加入2.1中不同濃度的待測試樣溶液0.5 mL，3%H2O2溶液1.0 mL（新鮮配制），混合后在37℃水浴中反應30 min，用紫外－可見分光光度計在520 nm處測定吸光度As；同法，以0.5 mL DMSO代替樣品溶液，測定吸光度A0；以0.5 mL DMSO代替樣品溶液，以1.0 mL蒸餾水代替3%H2O2溶液，測定吸光度A。用3.5 mL蒸餾水＋PSB緩沖溶液1.0 mL作參比溶液。取3次測試平均值，按下式計算清除率：

圖2 不同濃度下提取物對超氧陰離子自由基的清除率

2.2 DPPH自由基清除能力測定［7］DPPH用70%的乙醇配制成5×10～5 mol／L的溶液。取上述5×10～5 mol／L的DPPH溶液3.0 mL，加入2.1中不同濃度的待測試樣溶液1.0 mL，于25℃反應15 min，用紫外－可見分光光度計于517 n m處測定吸光度值As；取5×10～5 mol／L的DPPH 3.0 mL，加入DMSO 1.0 mL，同法測定吸光度值A0。用70%乙醇3.0 mL＋DMSO 1.0 mL作參比溶液。取3次測試平均值，按下式計算清除率：

3.2 對超氧陰離子自由基的清除作用 用光照核黃素的方法產生超氧陰離子自由基，可使氯化硝基四氮唑蘭產生藍色物質，該物質在560 n m處有最大吸收峰。隨著反應的進行，藍色物質的生成就越多，加入芒果皮提取物樣品溶液可使超氧陰離子自由基的產生受到抑制，進而藍色物質的生成也受到抑制。測定該波長下的吸光度值的變化，可反映芒果皮提取物對超氧陰離子自由基的清除能力。

芒果皮的水提取物（EW）、95%乙醇提取物（EEt）和石油醚提取物（EP）對DPPH自由基均有良好的清除作用，濃度越高，清除能力越強。通過回歸分析，得EP的DPPH自由基清除率線性方程為y＝10.6x＋4.954 5，R2＝0.954，IC50＝4.25 μg／mL；EW 線性方程為y＝13.707x＋5.477 3，R2＝0.954 5，IC50＝3.25μg／mL；EEt線性方程為y＝15.658x＋6.572 7，R2＝0.948 5，IC50＝2.77μg／mL。IC50越小，抗自由基活性越強。依據IC50值，3種提取物對DPPH自由基的清除能力大小為EEt＞EW＞EP。見圖1。

羥自由基非常活潑，在含氧自由基中其氧化活性最強，但存在時間短，一般難于直接測定。本文采用間接法測定，其原理是利用Fenton反應產生羥自由基：作用，其在藥品和保健品方面的應用開發具有巨大潛力，前景廣闊。本研究結果為芒果皮的深入開發利用提供了科學依據。

圖3 不同濃度下提取物對羥自由基的清除率

4 結論

本文研究表明，芒果皮的3種溶劑提取物對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基均有很好的清除作用，并且清除率與樣品濃度呈一定的線性關系，濃度越高，清除作用越強；采用不同的提取溶劑，所得到的提取物清除自由基的能力存在顯著差異，對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力為乙醇提取物＞水提取物＞石油醚提取物。因此，提取芒果皮的溶劑以選擇乙醇為宜。

采用SPSS 16.0軟件進行資料統計分析，符合正態分布的定性資料采用χ2檢驗，定量資料采用方差分析或重復測量設計方差，非正態分布資料采用非參數Kruskal-Wallis（校正）檢驗。

依據《導基》課程內容、考試大綱及導游人員崗位能力培養要求，進行總結和歸納，收集素材，分教學階段構建教學的內容項目和任務體系（如表1）。

現代醫學研究證明，自由基會引起人體蛋白質變性、酶失活、DNA鏈斷裂、生物膜結構損傷、細胞解體乃至機體病變和死亡，自由基及其誘導的氧化反應是導致生物衰老和某些疾病如癌癥、糖尿病、風濕性關節炎、心腦血管疾病等的重要因素。本文研究表明，芒果皮提取物對不同的自由基均有良好的清除

［1］Schieber A，Berardini N，Carle R.Identification of flavonol and xanthone glycosides from mango（Mangifera indica L.Cv.“Tommy Atkins”）peels by high－perfor mance liquid chromatography－electrospray ionization mass spectrometry［J］.Agric.and Food Chem，2003，51（17）：5006～5011.

［2］王維民，汪敏 .芒果皮粗多糖提取的影響因素及工藝的研究［J］.農產品加工（學刊），2005，9～131.

［3］Ajila C M，Bhat S G，Prasada R.Valuable components of raw and ripe peels from t wo Indian mango varieties［J］.Food Chemistry，2007，102（4）：1006～1011.

［4］黃敏琪，林忠文，曾憲彪，等 .芒果皮提取物止咳化痰和抗炎作用研究［J］.中草藥，2007，38（8）：1233～1234.

［5］覃麗儉，吳長興，吳莉宇 .杧果皮不同萃取物的抑茵活性初探［J］.熱帶農業科學，2007，27（2）：21～25.

［6］李琳，姜新發，張志斌，等 .枇杷皮和芒果皮粗提液抗氧化活性研究［J］.電子科技大學學報，2003，32（6）：755～759.

［7］L R Fukumoto，G Mazza.Assessing antioxidant and prooxidant activities of phenolic compounds［J］.J Agric Food Chem，2000，48（8）：3597～3604.

［8］劉杰超，王思新，焦中高，等 .蘋果多酚提取物抗氧化活性的體外試驗［J］.果樹學報，2005，22（2）：106～110.

［9］張建勝，王雪梅，高云濤，等 .伸筋草提取物體外清除活性氧自由基及抗氧化作用研究［J］.云南中醫中藥雜志，2008，29（3）：38～39.