miRNA-210在股骨頭壞死患者血漿中的表達變化

殷俊輝，張長青，牛 鑫，郭尚春，胡 斌，何海燕，汪 泱

(1、上海市第六人民醫院四肢顯微外科研究所，上海 200233；2、上海市第六人民醫院骨科，上海 200233)

近年來，關于血管形成的分子機制的相關研究逐漸成為研究的熱點，目前公認的機制主要是Notch/血管內皮生長因子 (VEGF)/神經誘導因子調控機制[1]，已證實miRNA可以影響細胞命運決定(Cell fate Decision)，其表達量受到血流量的調控[2]，且在基因調控血管生成的過程中，miRNA發揮著至關重要的作用。研究發現miRNAs通過靶基因E2Fs來調控低氧/缺血性的疾病中血管生[3]。

當前已發現的人的細胞中miRNA超過1400[4]，miRNA是一類長度約18～25nt的內源性非編碼小RNA，由一段具有發夾樣結構、長度約70～80nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)剪切后生成。在動物體內，它通過與靶基因mRNA分子3’UTR區結合，抑制靶基因的翻譯，負調控靶基因的蛋白水平[5]。同一個miRNA可以調控多個mRNA分子，不同的miRNA也可以調控同一mRNA分子[6]。根據預測，人類細胞中約1/3的蛋白編碼基因受miRNA的調控。miRNA有進化上的高度保守性、時序性、組織特異性等特點。研究發現它在胚胎發育、細胞進化、血管形成、腫瘤發生等許多重要病理生理過程中發揮著重要的調控作用[7-9]。目前尚未有相關的文獻資料提示缺血性股骨頭壞死疾病中miRNAs是否具有特異性的改變，本研究的目的旨在初步探討股骨頭壞死患者血漿中miRNA的變化，為研究股骨頭壞死的分子調控機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 為我院經X線及MRI確診為股骨頭壞死III期的病人及健康人作為對照。分別為：確診為激素性股骨頭壞死的患者11例及健康正常對照組4例。收集患者及對照組的血漿，所有標本-80°C保存。所有參與患者自愿簽署了知情同意書。

1.1.2 主要儀器 實時定量PCR儀7500(美國ABI)

1.1.3 主要試劑 miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miR-cute miRNA熒光定量檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 按miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書操作。

1.2.2 總RNA純度和濃度的檢測 使用超微量紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，記錄OD260值。RNA純度檢測：RNA溶液的OD260/OD280的比值(比值范圍1.8～2.1為純度合格)。樣品RNA濃度計算公式為：OD260×40×稀釋倍數(ng/μl)。

1.2.3 cDNA的合成 按miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作。

1.2.4 實時定量PCR按miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書操作。以U66為內參，引物序列及PCR產物片段大小為mi-RNA210 forwardprimer擴增產物為TgCCTCTgTgCgTgTgACAgC；U66上游：GCAAACTCGATCACTAGCTCTGC下游：AGAAAGAACCACCTCAGTAGTGTCTG擴增產物為117bp。

1.2.5 數據分析 數據采用2-△△CT法進行分析。變化倍數大于2為高表達，小于0.5為低表達。

1.3 統計學分析 以上實驗重復三遍，實驗數據用均數±標準差表示，采用SPSS 12.0統計軟件對實驗結果進行單因素方差分析，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

與對照組正常人相比：miRNA-210的表達水平在股骨頭壞死III期的患者血清中明顯升高，其上調變化倍數為2.385±0.128(P＜0.05)；在無股骨頭壞死的正常人血漿中則低表達，變化倍數為0.274±0.004(P＜0.05)。 如圖 1 所示。

圖1 股骨頭壞死患者與正常人血漿中miRNA-210的表達比較對照組：正常人血漿中miRNA-210表達變化；病例組：股骨頭壞死患者血漿中miRNA-210表達變化

3 討論

血性股骨頭壞死(AvNFH，Avascular necrosis of femoral head)至今仍是醫學界尚未攻克的難題之一，較其他部位的骨壞死為多見，與多種疾病及創傷有關。在整個世界范圍內，非創傷性股骨頭壞死者的數量已呈逐年上升的趨勢，激素性股骨頭壞死占非創傷性股骨頭壞死的首位，且其發病率仍呈增長趨勢。自20世紀70年代以來，骨壞死患者的數量增加了10倍。男女比例大概是1.6:1，特發性及激素性骨壞死的發病年齡在30～50歲[10]。創傷性血流中斷、減壓病、庫欣病、酒精中毒、血紅蛋白病、高血壓病和放射性元素及激素治療均可以導致股骨頭壞死[11-15]。其中服用激素治療的患者中10%-30%會發生股骨頭壞死。然而，到目前為止，骨壞死的發病機制仍不清楚。導致股骨頭壞死的最主要的病理生理機制是供應股骨頭血管的梗阻和缺血。而有關其發病機制的研究甚多，目前有脂質代謝紊亂學說、血管內凝血學說、骨質疏松學說、免疫復合物沉積引起動脈血管炎學說、靜脈內淤滯引起骨內高壓學說、激素對骨細胞的細胞毒作用學說等。這些學說雖側重點各不相同，但最后皆歸結為共同的一點，即均可導致股骨頭微循環障礙，引起股骨頭血液供應減少，最后發生股骨頭壞死性改變。

已證實miRNA-210在缺氧導致的血管新生及細胞凋亡、腫瘤的發生、DNA損傷的修復、過程中表達量明顯上升。而HIF-α與其表達量的上調直接相關[16]。miRNA-210上調促進血管內皮生長因子VEGF)及血管內皮細胞生成毛細血管網[17]。另外miRNA-126、miRNA92a等均已證實與生理或病理性的血管生成具有相關性[18]。本實驗發現股骨頭壞死患者血漿miRNA-210的表達水平較正常對照組明顯升高，與目前報道較多的心血管系統及腫瘤等疾病中miRNA-210的表達量改變情況基本一致，證明其在股骨頭壞死疾病過程中對股骨頭內血管的新生及凋亡可能存在一定的負調控作用，提示高表達的miRNA-210可能與股骨頭壞死的發生發展過程中的作用機制有關，值得進一步研究。

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