采用組織芯片技術進行蘇木精-伊紅(HE)染色技術標準化的研究

劉 勇，袁 晟

(江西省人民醫院病理科，江西 南昌 330006)

標準化是組織病理學實驗室建設和發展的方向之一[1]，也是病理科質量控制的重要組成部分，而標準化的主要內容是技術的標準化，蘇木精-伊紅(HE)染色方法是病理科最常用的染色方法，被稱為常規染色方法，所以，HE染色的標準化更是病理科質控的重中之重。組織芯片(組織微陣列)一般是指將數十至上千個小組織整齊地排放在一張載玻片上而制成的組織切片[2]。我們采用組織芯片技術制作了人體不同正常組織和不同腫瘤組織的組織芯片，分組進行了HE染色實驗，旨在不同類型的組織中找到一個標準的染色程序。

1 材料與方法

1.1 材料 從我院病理科2010年送檢新鮮標本中收集不同病理組織60例制作組織芯片，其中淋巴組織、胃腸腺上皮、皮膚鱗狀上皮、皮下結締組織、骨骼肌組織、子宮平滑肌組織、肝臟組織、乳腺組織、肺組織、胰腺組織各3例；淋巴腫瘤組織、胃腸腫瘤組織、皮膚鱗狀上皮腫瘤組織、肺腫瘤組織、乳腺腫瘤組織、肝臟腫瘤組織、子宮平滑肌腫瘤組織、骨骼肌腫瘤組織，胰腺腫瘤組織、甲狀腺腫瘤組織各3例。所有標本均按中華醫學會編著的《臨床技術操作規范—病理學分冊》的要求進行組織前處理。Mayer蘇木素染色液、伊紅Y染色液均購自貝索公司。

1.2 組織芯片制作 組織芯片制作：將熔化石蠟(加入等量的蜂蠟)制作4.0cm×2.0cm×1.0cm大小的空白蠟塊，設計10×6點組織列陣，用打孔機制成模塊。將原蠟塊放在45℃溫箱中烘5-10min，然后，用打孔針從組織塊選定部位逐個取出組織芯，組織芯直徑2mm，將組織芯放入預先設計的陣列模塊中，排布成組織芯片。最后，將制成的組織芯片面朝下放在銅板上，于55℃放置30min，輕壓模塊使組織芯在模塊中排平。對組織芯片蠟塊切片,切下的組織平整地粘貼于載玻片上。

1.3 方法 將HE染色中的幾個關鍵步驟進行分組染色：①其中烤片溫度分成5組：A：65℃ 30h、B：70℃ 30min、C：75℃ 30min、D：80℃ 20min，E：85℃15min。②Mayer蘇木素染色分成3組：Ⅰ：2min、Ⅱ：4min、Ⅲ：6min。③伊紅Y染色分成3組：a組：2min、b組：3min、c組 4min。 進行交叉分組染色。

2 結果

2.1 60例人體不同組織和腫瘤組織的組織芯片，每張組織芯片上60個樣品，排列整齊，外形為圓形或類圓形，較少的皺折和掉片現象(圖1)。

2.2 五個烤片組中，C、D、E三組切片的細胞、組織不夠清晰，染色色彩不鮮艷，A、B兩組細胞組織清晰，染色色彩鮮艷，但A組有少許組織掉片。

2.3 Mayer蘇木素染色的三個染色組：I組切片，染色稍淡，對于一些皮下結締組織、平滑肌組織的細胞核顯示不夠清楚，II組切片顯示各類組織中的細胞核清晰，核膜、染色質清晰可見，胞漿紅色鮮艷，未見蘇木素染色；III組切片染色過深，某些淋巴組織、大部分腫瘤組織的細胞核核膜、染色質顯示不清晰。

圖1 組織芯片排列整齊，外形為圓形或類圓形(HE染色×100)

2.4 伊紅Y染色組：a組切片：伊紅染色稍淡，顏色不夠鮮艷。一些纖維結締組織染色過淺；b組切片：伊紅染色深淺適中，顏色清晰艷麗，顏色層次分明，與藍色的細胞核對比突出。c組切片：染色稍深，顏色層次不分明，部分細胞核有伊紅著色至細胞核呈紫藍色，與細胞核對比不突出。

2.5 本實驗顯示，用70℃烤片30min，蘇木素染色4min，伊紅染色3min的實驗組進行HE染色效果最佳，組織結構清楚，細胞核蘇木素染色呈藍色，核膜、染色質清晰可辨，胞漿伊紅染色層次分明，顏色鮮艷(圖 2)。

圖2 細胞核清晰，核膜、染色質清晰可見，胞漿層次分明，顏色鮮艷(HE染色×400)

3 討論

組織芯片技術原理：組織芯片是通過組織芯片制作機細針打孔的方法，從眾多的組織蠟塊(供體蠟塊)中采集到數十至上千的圓柱形小組織(組織芯)，并將其整齊排放到另一個空白蠟塊(受體蠟塊)中而制成組織芯片蠟塊。然后，對組織芯片蠟塊進行切片，再將切片轉移到載玻片上制成組織芯片。組織芯片的特點是：體積小，信息含量大，一次性實驗即可獲大量結果。組織芯片可做HE染色、特殊染色、免疫組織化學染色、DNA和RNA原位分子雜交、熒光原位雜交。組織芯片蠟塊可做100～200張連續切片。這樣用同一套組織芯片即可迅速地對上百種生物分子標記 (如抗原、DNA和RNA)進行分析、檢測，因而倍受組織病理學家的重視[3]。1998年Kononen等[4]首次采用組織芯片技術將645例乳腺癌組織固定于載體上，同時進行多種基因的檢測，結果發現erbB-2和myc表達在雌激素受體(ER)陰性者明顯高于ER陽性者，p53陽性者明顯高于p53陰性者，而CCND1基因則與p53、ER、erbB-2表達無明顯關系。從此，眾多學者開始對組織芯片技術進行研究，組織芯片技術不斷發展和完善，其應用也愈來愈廣泛[5，6]。

我們制作了60例人體不同組織和腫瘤組織的組織芯片，僅用幾張芯片即完成了全部實驗，極大節約了研究經費和降低了勞動量，因此，應用組織芯片大規模高效檢測臨床組織樣本是可行的，組織芯片技術與傳統的病理學技術方法相比，具有快速、方便、經濟、準確的特點，其應用前景廣闊。

HE染色方法的建立已有一百多年歷史，其技術雖已很成熟，但由于不同組織內所含的成分不同，導致組織與玻片的粘附力不同；蘇木素和伊紅對不同組織的染色力也有一定的不同，所以不同的組織所需要的烤片時間、染色時間理論上也是不同的，并且，因為HE染色是一種多步驟、多因素決定的實驗方法，無論是手工還是機器操作，都存在著許多影響因素，甚至會出現不理想的染色結果,從而導致誤判和誤診[7]。在日常工作中，我們不可能對每一組織單獨染色，只能找出一個相對適合的染色程序，本實驗顯示，用70℃烤片30min，蘇木素染色4min，伊紅染色3min比較合適于大部分組織的染色，可作為病理實驗室質量控制的標準程序進行批量染色。此外，現在國內病理科用得比較多的Harrys蘇木素是退行性染色，需要用0.5%鹽酸酒精分化，而分化是比較難控制的一個步驟，不利于進行質量控制，我們推薦使用Mayer蘇木素進行核的染色，因為Mayer蘇木素是進行性染色，不需要分化，有利于設定標準化染色程序而進行質量控制。

[1]馬恒輝,周曉軍,陳國璋.淺淡組織病理學實驗室的標準化[J].診斷病理學雜志,2002,6:374.

[2]劉 勇,戴艷枝,袁 晟.采用組織芯片技術檢測乳腺癌中泛素、S期激酶相關蛋白2、細胞周期調控因子p27的表達[J].中華外科雜志,2004,5:309-310.