阿魏酸川芎嗪后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

趙潤英，郝偉，孟祥軍，李昭，趙麗妮，馬明洋，丁雙雙

（1.沈陽醫學院藥理教研室，機能實驗中心，藥物研究中心，沈陽 1 1 0 0 3 4；2.中國醫科大學9 7期臨床醫學專業，沈陽 1 1 0 0 0 1；3.沈陽博潤生物技術有限公司，沈陽 1 1 0 1 6 8）

冠狀動脈再通術是目前治療急性心肌梗死的重要手段，而缺血再灌注損傷卻成為阻礙缺血心肌從再灌注策略中獲得最佳療效的臨床難題，引起了人們極大的關注［1］。阿魏酸川芎嗪（ligustrazine ferulate，LF）是以阿魏酸和川芎嗪（ligustrazine，LZ）結構為基礎合成的阿魏酸鹽類化合物。有研究顯示，LF在抗血小板聚集方面表現出較好的藥理活性，且作用強于LZ，但其對心肌缺血再灌注損傷的作用鮮有報道。本研究旨在探討LF后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：健康雄性SD大鼠50只，體質量250~300 g，中國醫科大學實驗動物部提供。

1.1.2 儀器：BL-420F生物機能實驗系統和HX-100E小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；MiVnt圖像分析系統（上海光學儀器研究所）；7180全自動生化分析儀（日本HITACHI公司）。

1.1.3 藥品與試劑：鹽酸LZ注射液（20 mg/mL，安徽省立藥業有限公司）；LF注射液（20 mg/mL，沈陽醫學院藥物研究中心）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測測試盒、伊文氏藍和TTC染液（南京建成生物工程研究所）；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；Fas檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與心肌缺血再灌注模型的建立：48只雄性SD大鼠隨機分成假手術組（SM組）、缺血再灌注組（I/R組）、LZ組和LF組。采用結扎左冠狀動脈前降支30 min、再灌注120 min的方法，復制心肌缺血再灌注模型：大鼠20%氨基甲酸乙酯0.7 g/kg腹腔注射麻醉；四肢皮下插入針形電極、右頸動脈插管至左室，連接BL-420 F生物機能實驗系統，分別記錄Ⅱ導聯心電圖和血流動力學參數；右頸靜脈置管用于輸液給藥；氣管插管，接呼吸機；距胸骨左緣0.5 cm處，剪斷第3、4肋骨，打開胸腔，以左心耳與肺動脈圓錐之間的左冠狀靜脈作為結扎標志血管，用3/8弧4×12圓針穿4/0縫線（預先將一個帶凹槽的聚乙烯環穿在縫線上），在左心耳根部下方2 mm處，以深1.5~2 mm、寬2~3 mm穿過心肌表層，縫線兩端在聚乙烯環的凹槽處結扎左冠狀動脈前降支（以心電圖顯示ST段抬高為結扎成功標志）30 min；在聚乙烯環凹槽處剪斷結扎線，再灌注120 min（以抬高的ST段回落50%為再灌注成功標志）。SM組只穿線不結扎，LZ、LF組于再灌注前10 min頸靜脈注射 LZ、LF 40 mg/kg。

1.2.2 效應指標檢測

1.2.2.1 血流動力學指標 冠脈下穿好結扎線后，各組于缺血前（時點 1）、缺血 30 min（時點 2）、再灌注 120 min（時點 3）記錄心率（heart rate，HR）、左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室收縮末壓（left ventricular end systolic pressure，LVESP）和心室最大壓力上升和下降速率（±dp/dtmax）等參數。

1.2.2.2 氧化應激相關指標 再灌注結束后右頸動脈采血2 mL，靜置后3 000 r/min離心10 min，檢測血清中MDA的含量、SOD的活性。

1.2.2.3 心肌梗死范圍 右頸動脈采血后經頸靜脈注入5%伊文氏藍1.5 mL，待大鼠口唇藍染后取出心臟。將左室標本置于-20℃冰箱凍存20 min后取出，自心尖向心底平行房室溝方向切出相等厚度的5片心肌片；將切片置預溫37℃、1%TTC磷酸緩沖液中染色30 min后，再置于10%中性甲醛液中固定24 h；肉眼可見非缺血區為藍色、缺血非梗死區為磚紅色、缺血梗死區為蒼白色。計算心肌缺血范圍和心肌梗死范圍，心肌缺血范圍=缺血區面積（area at risk，AAR）/左室面積（1eft ventricle，LV）×100%，心肌梗死范圍=梗死區面積（infarct size，IS）/AAR×100%。

1.2.2.4 心肌細胞凋亡指數與凋亡相關基因表達將左室于4%甲醛（pH7.4）中固定48 h（4℃）后置于75%乙醇中，然后常規石蠟包埋，于心肌梗死區中部沿左室軸線每隔1 mm連續切取5張3~4 μm厚的切片，烤干備用。TUNEL法檢測凋亡心肌細胞。在光學顯微鏡下，凋亡細胞核呈棕色，正常細胞呈藍色。每張玻片隨機選擇6個高倍鏡（40×）視野，然后計算心肌細胞凋亡指數（apoptotic index，AI），AI=凋亡細胞數/心肌細胞總數×100%。免疫組化法檢測心肌組織Fas蛋白陽性細胞。在光學顯微鏡下，細胞核染成棕色為陽性細胞。計數6個高倍鏡（40×）視野Fas陽性細胞數，計算平均陽性細胞表達指數（positive express index，PEI），PEI=陽性細胞數/心肌細胞總數×100%。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。計量資料以x±s表示，3組及3組以上組間差異采用方差分析，差異有統計學意義時再用Dunnett法進行多個樣本均數的兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LF后處理對大鼠血流動力學的影響

缺血前各組血流動力學參數比較，差異無統計學意義（P>0.05）；與 SM 組比較，I/R、LZ、LF 組 HR、LVESP、±dp/dtmax等指標均降低，LVEDP均升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與I/R組比較，LZ、LF能加快HR、升高LVESP和±dp/dtmax、降低LVEDP，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 LF后處理對大鼠氧化應激相關指標的影響

血清生化指標檢測結果顯示：與SM組比較，I/R組血清MDA含量明顯提高，SOD活性明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）；LZ、LF能明顯降低血清MDA含量、提高SOD的活性，與I/R組比較差異有統計學意義（P<0.01），但LZ、LF組尚未達到SM組的水平，與之比較差異仍有統計學意義（P<0.01）。見表2。

表1 L F對大鼠血流動力學的影響T a b.1 T h e e f f e c t s o f L Fp o s t c o n d i t i o n i n g o n t h e p a r a me t e r s o f h a e mo d y n a mi c s i n r a t s

2.3 LF后處理對大鼠心肌梗死范圍的影響

伊文氏藍和TTC雙重染色后檢測心肌梗死范圍結果顯示：SM組未見缺血區；除SM組以外，其余各組大鼠的心肌缺血面積無明顯差異（P>0.05）；LZ、LF能明顯縮小大鼠心肌梗死范圍，與I/R組比較差異均有統計學意義（P<0.01）。見表2。

2.4 LF后處理對大鼠心肌細胞凋亡及凋亡相關蛋白Fas表達的影響

TUNEL法檢測心肌細胞凋亡與免疫組化法檢測凋亡相關蛋白Fas表達的結果顯示：SM組凋亡心肌細胞及Fas蛋白陽性細胞極少；與SM組比較，I/R、LZ、LF各組大鼠凋亡心肌細胞及Fas蛋白陽性細胞明顯增多，差異均有統計學意義（P<0.01）。與I/R組比較，LZ、LF能明顯抑制心肌細胞凋亡和凋亡相關蛋白Fas的表達，降低心肌細胞AI和Fas蛋白的PEI，差異有統計學意義（P<0.01）。除血流動力學指標外，LF對大鼠氧化應激相關指標、心肌梗死范圍、心肌細胞AI和Fas蛋白表達的影響等作用均強于LZ，LF組與LZ組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是溶栓、經皮冠狀動脈腔內血管成形術或動脈搭橋等冠狀動脈再通術術后的重要并發癥，臨床表現為心臟舒縮功能障礙，如心肌頓抑、心律失常、心力衰竭等［2］。LVESP、LVEDP、±dp/dtmax是評價心肌收縮功能常用的指標，LVESP和+dp/dtmax降低反映左室收縮功能下降，LVEDP升高和-dp/dtmax下降反映左室舒張功能降低。本研究所測血流動力學指標結果顯示，LF使 HR、LVESP、±dp/dtmax升高，而LVEDP降低，說明LF后處理能提高缺血再灌注大鼠的心肌收縮力，增加心室順應性，改善心臟功能。心肌缺血再灌注損傷的發生機制至今尚未完全闡明，目前認為與氧自由基損傷、鈣超載、能量代謝障礙、血管內皮細胞損傷、細胞凋亡和中性粒細胞浸潤等因素有關［3］，其中大量氧自由基的產生是導致心肌損傷最主要的原因。心肌缺血再灌注時，氧自由基通過多種途徑生成增加，它與脂質發生過氧化反應形成脂質過氧化物，引起心肌細胞氧化應激損傷。SOD是清除氧自由基所必需的酶，能保護心肌細胞免受損傷，其血清活性的高低反映了缺血再灌注心肌抗氧化的能力。MDA是氧自由基攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化反應的產物，其血清水平的高低反映了機體受自由基攻擊的嚴重程度。本研究顯示，LF后處理能明顯提高血清SOD的活性并降低MDA水平，表明外源性LF藥物后處理可提高機體的抗氧化能力。因此，抑制自由基生成或清除氧自由基可能是LF對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的機制之一。而氧自由基在引起心肌細胞氧化應激損傷的同時，還會誘導心肌細胞凋亡。細胞凋亡的途徑主要有兩條，一是通過胞外信號激活細胞內的凋亡酶caspase，二是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細胞內的重要蛋白降解，引起細胞凋亡［4~6］。細胞凋亡是受基因調控的精確過程，涉及 ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas、c-myc、p53、ATM等蛋白。Fas又稱作APO-1/CD95，屬TNF受體家族。Fas蛋白與Fas配體結合后，會激活caspase，導致靶細胞走向凋亡［7~9］。因此，抑制Fas蛋白的表達進而抑制細胞凋亡可能是LF對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的另一機制。

阿魏酸和LZ是活血化瘀中藥川芎、當歸的有效成分，臨床廣泛應用于缺血性心腦血管疾病的治療，現已人工合成。二者對心肌缺血再灌注損傷均具有保護作用，并在配伍應用中表現出明顯的協同效果［10］。本研究對以阿魏酸和LZ結構為基礎合成的LF，進行了抗缺血再灌注損傷作用與機制研究，結果顯示：LF后處理能夠提高抗氧化酶的活性，清除氧自由基，在抑制脂質過氧化反應，減少心肌細胞氧化應激損傷的同時，還能通過下調凋亡相關基因Fas蛋白的表達，抑制心肌細胞凋亡，從而對心肌缺血再灌注損傷產生良好的保護作用。

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