單耐利福平結核分枝桿菌耐藥分子機制研究

逄宇 李桂蓮 王玉峰 宋媛媛 李強 歐喜超 董海燕 趙雁林

結核病是全世界范圍內最主要的傳染病之一［1］。半個世紀前，由于使用了抗結核藥物，結核病疫情得到一定的控制［2］。然而，由于耐藥結核病，特別是耐多藥（multi-dr ug resistant，MDR）結核病的出現影響了結核病的有效治療和控制［3］。因此，理解Mtb耐藥機制對于解決上述問題具有重要意義。目前已經有大量研究揭示了Mt b的分子生物學和遺傳學的耐藥機制，包括利福平（r poB）、異煙肼（kat G、inh A 等）、鏈 霉 素 （rsp L、rrs 等）、喹 諾 酮（gyr A 和gyr B）等［4］。

RFP是目前最主要的一線抗結核藥物，同時也是組成有效治療方案并決定治療效果的關鍵因素，文獻表明對RFP耐藥的菌株中大多數也對INH耐藥［5］，因此研究Mtb對RFP的耐藥機制對結核病，尤其是是耐RFP和MDR患者的治療有著重要意義。RFP通過與Mtb RNA聚合酶的β亞基（由r poB編碼）相結合從而抑制RNA的合成。文獻報道表明約有90%以上的RFP耐藥性是由于r poB基因的81-bp（編碼密碼子507-533位）的RFP耐藥決定區（rifampicin resistance deter mining region，RRDR）的突變引起［6］。但是攜帶RRDR區不同位點突變的菌株最低抑菌濃度（mini mu m inhibitor y concentration，MIC）存在較大差別。本研究通過選取單耐RFP菌株探究不同r poB的突變類型與MIC的關系，同時在單耐藥菌株中確定與RFP耐藥有關的藥物外排泵基因。

材料和方法

一、菌株和培養條件

本研究菌株來自2007—2008年全國結核病耐藥基線調查［1］，總計約4000株菌株中分離獲得單耐RFP菌株23株。所有分離株存放于10%甘油的蘇通培養基，并置于-70℃冰箱中。在進行藥敏實驗前將凍存菌株在改良中性羅氏培養基上復蘇4周。

二、羅氏培養基比例法藥物敏感度實驗和菌種鑒定

羅氏培養基比例法藥物敏感度實驗和分枝桿菌菌種鑒定參照文獻［1］進行。培養基內藥物的終濃度分 別 為：INH 0．2μg／ml、RFP 40μg／ml、S 4μg／ml、EMB 2μg／ml、Km 30μg／ml、Of x 2μg／ml。利用對硝基苯甲酸生長實驗和噻吩-2-羧酸肼生長實驗對分枝桿菌菌種進行鑒定，培養基內藥物濃度為：對硝基苯甲酸500μg／ml、噻吩-2-羧酸肼5μg／ml。

三、DNA標本制備

無菌生理鹽水洗下菌株新鮮培養物，吸取菌懸液1 ml于無菌Eppendorf扣蓋離心管中，80℃30 min滅活，離心去上清，菌體沉淀用500μl TE緩沖液（p H 8．0）充分懸浮，95℃水浴1 h，10 000×g離心15 min，取上清即為PCR擴增模板。

四、r poB基因的擴增和測序

用表1所示引物擴增rpoB基因，PCR產物大小為450 bp，含81 bp的RRDR區。擴增體系如下：5μl PCR Buffer，2 mmol MgSO4，200μmol d NTP，兩條引物各0．2μmol，2μl基因組 DNA 及0．5μl Trans Hi Fi Taq酶。反應條件：預變性94℃5 min；循環94℃1 min，60℃1 min，72℃30 s 35個循環；72℃ 延伸10 min。PCR產物送擎科公司用ABI3730測序儀進行測序。測序結果采用在線比對軟件http：／／blast．ncbi．nl m．nih．gov／Blast．cgi與標準敏感株H37 Rv基因序列進行比對。

表1 本研究中用于PCR擴增和測序的引物

續表1

五、Mt b MIC測定

按照文獻［7］所述選用微孔板Alamar Blue法進行檢測。

六、細菌總RNA的制備及反轉錄合成c DNA

Mtb在7 H9液體培養基上37℃培養28～32 d后，收集菌體，參照文獻［8］，采用Trizol法提取總RNA，并反轉錄成c DNA。

七、real-ti me PCR

采用SYBR法real-ti me PCR試劑盒（全式金生物技術有限公司生產）試劑盒，反應體系為20μl，按照文獻［9］，選用表1所述引物對擴增目的基因。內參基因為DNA聚合酶編碼基因pol A［8］。

八、大腸埃希菌表達載體構建及轉化

擴增Rv2936、Rv0783和Rv0933完整讀碼框，將片段連入p EASY-E1原核表達載體中，陽性克隆送擎科公司測序驗證。陽性克隆轉化入大腸埃希菌BL21菌株。

九、大腸埃希菌MIC測定

［10］，采用微孔板Alamar Blue法進行檢測。

結 果

一、菌株耐藥相關基因的測序結果

選取的23株單耐RFP菌株，發生r poB突變16株，突變率69．6%，其中包括531、526和511等3種突變位點類型，其所占比例分別為39．1%（9／23）、26．1%（6／23）和4．3%（1／23）。根據突變密碼子的改變情況，531 TCG（Ser）→TTG（Leu）9株（39．1%）；526CAC（His）→GGC（Gly）和526CAC（His）→GAC（Asn）各2株（8．6%）；526CAC（His）→CTC（Leu），526CAC（His）→CGC（Ar g）和 533 CTG（Leu）→CCG（Pr o）各1株（4．3%），見表2。

表2 單耐RFP菌株中的突變和MIC統計表

二、不同r poB突變類型對RFP耐藥情況的影響

根據不同突變類型密碼子的改變情況，筆者統計了不同突變對RFP MIC的影響，結果如表3所示。其中突變類型Ser531Leu、His526 Asp表現為高濃度耐藥，其MIC分別為192μg／ml和256μg／ml；而突變類型 His526Gly、His526Leu、His526 Ar g和Leu533Pr o表現為低濃度耐藥，其MIC分別為0．75μg／ml、4μg／ml、2μg／ml和0．5μg／ml。

表3 不同r poB突變類型對RFP耐藥的影響

三、不同藥物外排泵基因在7株r poB無突變耐藥株中的表達差異

與標準株H37Rv相比，各耐藥株按照其MIC由低到高排列。如圖1所示，real-ti me PCR結果表明隨著耐藥程度的升高，20個藥物外排泵基因表現出不同的轉錄譜，其中Rv2936、Rv0783和Rv0933的轉錄水平與MIC正相關，高濃度耐藥的TB22和TB23兩株菌株中，上述3個基因的表達水平明顯高于其他菌株；而其他17個藥物外排泵基因的轉錄水平與MIC濃度無明顯關系。

圖1 不同菌株外排泵基因轉錄水平分析

四、轉基因細菌對RFP耐藥情況的改變

在轉入p EASY-E1的對照組中，大腸埃希菌對RFP表現出一定的天然耐藥性，其MIC為8μg／ml，分別轉入p EASY-E1-Rv2936和p EASY-E1-Rv0783的大腸埃希菌的MIC均有不同程度的提高，分別為32μg／ml和16μg／ml，而轉入p EASY-E1-Rv0933的大腸埃希菌 MIC為8μg／ml，見表4。

表4 過表達Rv2936、Rv0783和Rv0933對大腸埃希菌RFP MIC的影響

討 論

RFP是目前應用最為廣泛的抗結核藥物，其作用靶標為Mtb中DNA依賴的細菌RNA聚合酶β亞基，通過與其結合，干擾并抑制細菌RNA的合成，進而抑制細菌的生長繁殖導致細菌的死亡［6，11］。r poB突變，特別是RRDR區的突變導致Rpo B蛋白的結構改變，從而影響了RFP與藥物靶標的結合效果，進而使Mt b產生耐藥性。本次選取23株單耐RFP的研究中，有16株檢測到r poB基因突變，其中包括3種突變類型，涉及6種氨基酸變化。在所有檢測到r poB突變的菌株中，531位點和526位點突變率之和為93．8%（15／16），這2個位點在耐RFP菌株中的突變頻率較高，這與其他研究結果類似［6，12-13］。

此外，本研究發現r poB基因不同位點的突變導致的耐藥水平是不同的，這在先前有過報道。首先，對于531位點而言，絲氨酸變為亮氨酸導致Mt b高濃度耐藥。絲氨酸屬于極性中性氨基酸，而亮氨酸屬于非極性疏水性氨基酸，2種氨基酸在生化性質方面存在較大差異，因此推測可能對RpoB蛋白結構影響較大，從而誘發高濃度耐藥。其次，本研究中526位點突變包括4種類型，其中野生型526位點應為組氨酸，組氨酸為一種堿性氨基酸，當其突變為極性中性的天冬酰胺時，產生的突變菌株的MIC達到256μg／ml；而當組氨酸突變為非極性疏水性的亮氨酸和脯氨酸或突變為堿性的精氨酸時，突變菌株的MIC均低于4μg／ml，上述結果提示對于526位點，由堿性氨基酸突變為極性中性氨基酸時對rop B蛋白質結構影響要大于突變為非極性疏水性氨基酸或其他堿性氨基酸；再次，對于533位點，當由非極性疏水性的亮氨酸突變為同類型的脯氨酸時，對MIC的影響較小。以上的結論僅是基于耐藥菌株的耐藥表型的推測，需要得到結構生物學的研究結果的進一步證實。

藥物外排泵是微生物耐藥的一種重要機制，細菌外排泵的功能和結構生物學研究是目前熱點之一，然而對 Mt b外排泵研究還處于探索階段［4，14］。目前已有研究克隆獲得部分可能與非結核分枝桿菌耐藥相關的外排泵基因，其中包括與喹諾酮耐藥相關 的 Lf r A［15］和 Rv2686-Rv2687-Rv2688［16］，與INH 耐藥相關的 mmp L-7［17］和ini A［18］，與氨基糖苷類耐藥相關的P55［19］等，此外也有文獻報道Rv1410和Rv2136與INH、RFP或S的聯合耐藥相關［9，20］。本研究選用單耐RFP菌株，目的在于尋找RFP耐藥相關的藥物外排泵基因，通過對r poB基因的測序，排除了藥物靶標基因改變對耐藥性影響。進一步對20個外排泵基因轉錄水平進行研究，發現Rv2936、Rv0783和Rv0933在高耐藥菌株中的表達水平高于低耐藥菌株及敏感株H37 Rv，推測上述3個藥物外排泵基因可能與RFP耐藥相關；進一步通過轉基因實驗研究證實，Rv2936和Rv0783可能將RFP從菌體泵出致使菌內濃度減少，從而使Mtb對RFP的耐藥性增加。有研究表明，在r poB 531突變的菌株中，伴有Rv0783轉錄水平顯著提高（與全敏感組相比）。本研究進一步證實Rv0783和Rv2936可能是RFP耐藥相關的藥物外排泵基因，其中首次報道Rv2936作為RFP耐藥相關的藥物外排泵。Rv0933屬于ABC家族轉運蛋白，該家族蛋白在原核細胞和真核細胞中均有發現，并且負責跨膜轉運多種分子，包括離子、氨基酸、多肽、抗生素、多糖等各種分子［19］。有研究表明Rv0933可能與磷酸鹽的轉運相關［21-22］，磷酸鹽對于Mtb的生長具有重要作用，因此推測Rv0933可能通過改善菌體的營養狀況而在RFP耐藥表型中發揮一定輔助作用，但上述作用必須與藥物外排泵協同發揮作用，僅高水平表達Rv0933的菌株不能表現為耐藥。

本研究僅在大腸埃希菌中完成了轉基因功能驗證試驗，希望后續工作可以在恥垢分枝桿菌中展開，并從生物化學及結構生物學角度證實上述外排泵的功能；本研究中存在的另一個不足為僅在r poB未突變菌株中研究了藥物外排泵的功能，而藥物外排泵與耐藥基因突變2種機制可能在耐藥過程中協同發揮作用，下一步研究將圍繞上述問題開展。最后，對Rv0783和Rv2936啟動子區進行研究將有助于理解Mt b外排泵基因表達調控與耐藥性之間的關系。

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