熒光定量PCR技術對前驅期小兒結核性腦膜炎的應用價值

劉彥軒 賈安奎 郭盛菊 石太新 尚好珍

結核性腦膜炎（簡稱“結腦”）是由Mt b侵入蛛網膜下腔引起軟腦膜、蛛網膜病變，進而累及腦實質和腦血管的神經系統結核病，是小兒最常見和最嚴重的肺外結核病之一，死亡率高達30%～50%，存活患兒中約20%～50%遺留永久性神經系統后遺癥（偏癱、失語、失明等），若早期診斷和及時合理治療，大多數患者可獲痊愈，因此早期診斷是決定患兒預后的關鍵因素［1］。但目前臨床診斷結腦，多依靠病史、癥狀、體征、試驗性治療及實驗室檢查等綜合性指標來判定，傳統實驗方法如涂片、培養和結核抗體檢測等方法難以滿足臨床早期診斷的需要。陳效友等［2］報道以Taq酶標記的FQ-PCR檢測痰和血標本中Mt b靈敏度高達10-18kg DNA和1～5個菌體／ml，比普通PCR高10～100倍。為進一步研究其對結腦早期診斷、療效評估及與預后的關系、作用和意義，筆者做了以下探討，以期為臨床提供診療思路和積累試驗數據，現報告如下。

對象和方法

一、研究對象

2007年3月至2011年2月間河南省結核病醫院結核內科和河南省新鄉醫學院第一附屬醫院豫北兒科診療中心5個小兒內科的住院患兒共147例。納入研究的小兒分為結腦組和對照組。

1．結腦組：為前驅期結腦患兒，共117例。其中男61例，女56例；年齡6個月至7歲，中位年齡2．2歲，平均2．4歲。納入標準：患有肺結核或有與活動性結核病患者密切接觸史的患兒，煩躁、精神萎靡、呆滯、嗜睡、消瘦或體質量不增、低熱，不明原因反復嘔吐，嬰幼兒皺眉、以手擊頭、啼哭，年長患兒自訴頭疼，無抗結核治療史且腦脊液Mt b培養陽性（符合“金標準”）。排除標準：腦脊液 Mt b培養陰性，即選例時疑似結腦患者，治療前采集腦脊液檢測，隨即進行治療，若培養Mt b陰性則不計入本組研究范圍。

2．對照組（非結腦組）：30例，男女各15例；年齡5個月至6．5歲，中位年齡2．4歲，平均2．7歲。為我院小兒內科診斷為非結核分枝桿菌感染的腦膜炎或其他腦炎的住院患兒，納入標準：根據臨床表現、體征，腦脊液蛋白質、氯化物、葡萄糖等生化指標的變化，以及細胞種類和計數，一般抗生素治療有效或腦脊液中查到特異性病毒抗體Ig M，或培養出一般細菌［3］，且腦脊液培養 Mtb陰性。病種包括：病毒性腦膜炎18例、化膿性腦膜炎6例、隱球菌腦膜炎5例、流行性乙型腦炎1例，此幾種疾病診斷符合參考文獻［4］的診斷。治療前采集腦脊液，再治療，若Mtb培養陽性或并發結腦者，則不計入該組研究范圍。

3．兩組一般臨床資料比較：各組間年齡、性別、體質指數（body mass index，BMI）差異無統計學意義（P 值均＞0．05），具有可比性（表1）。

表1 各組一般臨床資料比較

二、研究方法

治療前無菌采集所有疑似結腦患兒和對照組患兒腦脊液分別置于2個無菌試管，每管2 ml。均置4℃冰箱過夜，由另一實驗員通過數字表法隨機編號，一管取薄膜層接種培養，另一管進行FQ-PCR檢測，記錄培養和Mtb DNA結果，按上述納入標準選擇結腦組117例和對照組30例患兒，比較各統計指標。

結腦組患兒抗結核治療3周后，再行培養和FQ-PCR檢測，分別計算陽性檢出率。

對結腦組患兒出院時培養和FQ-PCR陰性者，隨訪觀察2年并記錄復發情況；隨訪78例患者，另外32例未達隨訪時間繼續觀察，7例失訪。其治愈的標準是：（1）臨床癥狀、體征完全消失，無后遺癥。（2）腦脊液常規檢查正常（腦脊液外觀、細胞數、蛋白質、糖、氯化物等）。（3）療程結束后隨訪觀察2年無復發。

結核性腦膜炎臨床診斷的“金標準”是腦脊液Mtb涂片或培養陽性。快速Mtb培養采用美國BD公司生產的BACTEC T M MGITTM960全自動分枝桿菌檢測系統和配套培養基及相關試劑，培養和鑒定周期平均12 d。

FQ-PCR儀器為中山大學達安基因股份有限公司生產DA7600型擴增儀，相關試劑由該公司提供。標本處理如下：取腦脊液薄膜層100μl加入等量DNA濃縮液（主要成分為聚乙二醇600、Na Cl），振蕩數秒，9900×g離心10 min，棄上清液后加入50μl DNA提取液［主要成分為Na OH、Tris-HCl、Triton X-100、NP-40、Chelex-100、乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA）］，于干式恒溫器（中山大學達安基因股份有限公司生產，型號：K30B）100℃恒溫浴10 min。以9900×g離心10 min，取上清液2μl加入毛細管進行PCR反應，每批加有陰、陽性質控品和4個濃度的TB陽性定量參考品（結核分枝桿菌核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供），擴增檢測步驟按試劑盒操作說明進行，擴增曲線呈s型，且Ct值＜30，Mt b-DNA含量＞5．0×101拷貝／ml為陽性。

FQ-PCR檢測靈敏度、特異度、診斷指數、陽性預測值、陰性預測值指標見參考文獻［5］。

三、統計學處理

結 果

一、二組FQ-PCR檢測與金標準比較

金標準培養結果：結腦組（培養陽性117例），對照組（培養陰性30例）。

收集整理初診患兒符合條件的117例結腦組和30例對照組FQ-PCR檢測結果發現，結腦組FQPCR均為陽性，對照組FQ-PCR陰性29例，陽性1例（表2）。

表2 兩組FQ-PCR檢測與金標準結果比較（例）

FQ-PCR檢測與金標準比較靈敏度100．0%（117／117），特 異 度 96．7% （29／30），診 斷 指 數196．7%（100．0%＋96．7%）＞170．0%，陽性預測值99．2%（117／118），陰性預測值100．0%（29／29），符合率99．3%（146／147）。FQ-PCR檢測結果與金標準采用四格表評價模式進行比較，差異無統計學意義（χ2＝0．000，P＝1．000）；相關性分析r＝0．9790，二者有相關關系（χ2＝140．9，P＝0．000）。

二、結腦組患兒抗結核治療3周后復檢結果

117例結腦組患兒抗結核治療3周后復檢，培養法、FQ-PCR法檢測陽性例數分別為32例和68例，陽性檢出率分別為27．35%（32／117）和58．12%（68／117）。兩者陽性率差異有統計學意義（χ2＝22．63，P＝0．000）?；純号R床癥狀均有不同程度好轉，其中有42例患者臨床癥狀基本消失，與FQPCR檢測陰性例數較為接近，此42例患兒的培養法和FQ-PCR法檢測結果均為陰性，培養法檢測陽性的32例患兒包含在FQ-PCR法檢測陽性的68例中。

三、隨訪患兒復發情況

筆者對結腦組患兒出院時培養法和FQ-PCR檢測陰性的患兒進行了隨訪，觀察2年后復發情況。共隨訪78例患兒，另外32例未達隨訪時間，7例失訪。此78例患兒出院時培養法均為陰性，FQ-PCR法69例陰性，9例陽性。隨訪結果為培養法陰性的78例患兒有7例復發（8．97%），FQ-PCR陰性69例患兒0例復發，差異有統計學意義（χ2＝4．6736，P＝0．0306）。FQ-PCR檢測陽性的9例中有7例復發。

討 論

腦脊液病原體培養是實驗診斷結腦的“金標準”，但結核患兒腦脊液中由于含菌量低、菌活力低以及L型菌（Mt b的一種細胞壁缺陷變異型）的出現等細菌生物學性狀的改變［6］，很容易漏診，加之培養所需時間長，通常4～8周出結果，且靈敏度低，嚴重影響了結核病的早期診斷和及時治療［7］，無法滿足臨床早期診斷結腦的需要。早期結腦的病死率不足10%，但晚期可達60%以上［8］。因此，準確、快速診斷結腦是治療和預后的關鍵，Deshpande等［3］認為PCR是首選，它在結腦處于非常初期階段就可以診斷［9］。

筆者采用FQ-PCR對結腦組和對照組與金標準進行了盲法對比的研究，各組間年齡、性別、BMI差異無統計學意義（P＞0．05），具有可比性。在經金標準確診的117例結腦患兒中，FQ-PCR檢測全部為陽性，敏感度為100．0%，非結腦組（對照組）檢出1例陽性，特異度為96．7%，靈敏度高于文獻［10-11］的90%和94．4%，特異度低于二者的100．0%。Deshpande等［3］觀察到PCR擴增的靈敏度和特異度在臨床標本之間差異較大，在不同的實驗室，從50%～90%和60%～100%。作者認為上述文獻低靈敏度的原因可能是所選用患者標準不同（本研究所選患者組均為Mtb培養陽性，靈敏度達100．0%），同時與PCR方法、探針不同，腦脊液中低負荷DNA或者細胞壁堅韌目標DNA分離困難［12］、腦脊液量不足、腦脊液中存在抑制擴增的物質［11］、以及細胞裂解或在純化過程中DNA提取方法不同所致，實驗防污染措施不到位也會導致特異度降低。FQ-PCR在PCR反應體系中加入熒光化學基團，Taq Man探針對目標序列特異性高，特別適用于單核苷酸多態性（SNP）的檢測［13］，FQ-PCR 全“封閉”式的操作、d UPT-UNG酶防污染體系的設立，在相當的程度上解決了普通PCR難以避免的實驗污染問題。FQ-PCR熒光檢測比普通PCR后的電泳檢測靈敏度要高2～3個數量級［14］，而傳統的涂片抗酸桿菌染色檢查需每毫升痰標本達到5000～10 000條菌以上才可能檢出［15-16］，培養法的靈敏度可達10條／ml，但一般需要4～8周才能報告結果［16］，FQ-PCR檢測痰和血標本中Mtb靈敏度高達10-18kg DNA和1～5個菌體／ml，無疑可以提高方法的靈敏度和特異度，達到早期診斷的目的。本文所選患兒均為前驅期結腦患兒，診斷指數達196．7%，符合率為99．3%，陽性預測值為99．2%，陰性預測值則為100．0%，r＝0．9790，提示 FQ-PCR在診斷性試驗評價真實性的診斷效能指標和應用價值的統計指標，以及可靠性方面，均取得較佳效果。而文獻［10］靈敏度僅為50%，可能與方法、試劑和患者選擇（患者平均年齡為38歲，60%的患者為男性，而且72%的患者為HIV陽性）有關。

117例結腦組患兒治療3周后2種方法同時檢測，培養法陽性率為27．35%，FQ-PCR為58．12%，兩者差異有統計學意義。這是因為藥物治療改變了細菌的生物學活性，抑制了Mt b生長，致使陽性率下降；而FQ-PCR檢測的是Mtb特異性基因片段，只要沒有引起檢測位點基因突變，理論上都可以檢測出陽性結果。因而可以分析出，FQ-PCR法在監測藥物對Mt b清除效果方面，更符合機體實際情況，而且可以精確了解Mt b復制及含量。

為更進一步了解2種方法對療效和預后評估的作用和意義，筆者對結腦組出院時2種方法各自檢測陰性患兒做了隨訪工作，培養法檢測陰性78例患兒有7例復發，FQ-PCR陰性69例患兒均無復發，差異有統計學意義。78例培養陰性的患兒除了FQ-PCR同為陰性的69例外，還有9例FQ-PCR檢測陽性，9例中有7例復發，2例含量較低的患兒未復發。筆者發現復發患兒是因為治療效果不佳還存在Mtb，而培養法又檢測不到，誤認為治愈所致。提示盡管培養法檢測陰性，由于本身靈敏度差及其藥物治療的影響，未必腦脊液中就沒有Mtb存在，而FQ-PCR因為其高靈敏度，在預后評估方面更具說服力。

綜上所述，筆者認為FQ-PCR檢測腦脊液Mt b DNA準確、簡便、快速，對早期結腦診斷、治療具有獨特的優勢，對療效監測和預后評估比培養法更具實際應用價值。本研究不足之處在于，文中只分了培養陽性結腦組和非結腦組兩組患兒，沒有將培養陰性的結腦患兒進行比較分析，若都計算在內，盡管FQ-PCR陽性率會降低，但也許更能體現其作用和價值，這一問題有待今后進一步研究探討。

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