大鼠靜脈竇血栓形成后VEGF和VEGF mRNA的表達及意義

閆文浩， 吳 軍

顱內靜脈竇血栓形成(cerebral venous sinus thrombosis，CVST)是一種特殊類型的腦靜脈系統血管疾病，成人發病率為3～4/100萬，占所有卒中的0.5% ～1%［1］，約 15% 的患者最終死亡或致殘［2］。與腦動脈血栓相比，腦靜脈系統血栓的研究比較少，近些年來隨著臨床醫生對該病的重視及神經影像學的發展，使本病確診率不斷提高，顱內靜脈系統血管病逐漸引起關注。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種特異性作用于血管內皮細胞的分泌性細胞因子，具有促進內皮細胞增殖和血管生成、增加血管通透性等多種功能，VEGF在腦動脈缺血中的相關研究國內外已有較多報道，但對于腦靜脈缺血的報道較少，本研究采用大鼠顱內靜脈竇血栓形成模型，觀察顱內靜脈竇血栓形成后VEGF及VEGF mRNA表達的變化過程，并探討其可能意義。

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠60只(清潔級)，體重 220～280g，由廣東省實驗動物中心提供，合格證號:SCXX(粵)2008-0002。實驗動物隨機分為2組:(1)CVST實驗組(n=30):根據模型制作后不同時間又分為1d、3d、7d等3個亞組(每亞組10只);(2)假手術對照組(n=30)，分為1d、3d、7d等 3 個亞組(每亞組10 只)。

1.2 動物模型 參考文獻［3，4］方法并稍作改進，將大鼠用10%水合氯醛(340～360mg/kg)經腹腔注射麻醉，頭部剃毛并固定于腦立體定位儀上，直腸內插入溫度傳感器，體溫維持儀維持體溫在37.0℃ ±0.5℃。消毒皮膚，以枕骨粗隆為起點，向額部做長度為1.5cm正中線皮膚切口，用棉簽擦除骨膜，顯露正中頂骨和枕骨鱗部，于Lambda、Bregma前端(即上矢狀竇前后兩端)以矢狀縫為軸，分別設計骨窗3mm×3mm，手術顯微鏡下生理鹽水持續冷卻，高速顱鉆磨除骨板，暴露硬腦膜及上矢狀竇前后兩端。CVST實驗組用9-0顯微縫合線結扎上矢狀竇前后兩端，盡量減少對腦組織的損傷，10min后微量注射泵以10μl/min的速度在上矢狀竇(Superior Sagittal Sinus，SSS)近尾部結扎處向SSS腔內注射約100μl腦磷脂白陶土懸浮液(APTT試劑盒，4℃保存，購于廣州倍新生物科技公司)。確定無出血后消毒，嚴密縫合頭皮，腹腔注射青霉素15萬u預防感染。回籠飼養，溫度控制在24℃。24h內磁共振靜脈血管成像(Magnetic resonance venography，MRV)未見上矢狀竇顯影證實模型成功(見圖1)，定為CVST實驗組;假手術對照組開顱暴露硬腦膜及上矢狀竇前后兩端后用針線穿過上矢狀竇下方，但不結扎上矢狀竇及注入腦磷脂白陶土，余試驗過程同模型組。

1.3 標本采集 術后1d、3d、7d分別將 CVST實驗組和假手術對照組中的5只以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，先用37℃ 0.9%生理鹽水經左心室灌流，后迅速以4%多聚甲醛經左心室灌流固定，迅速斷頭取腦后固定，石蠟包埋，石蠟切片機上行5μm冠狀位連續切片并編號備用;CVST實驗組和假手術對照組每亞組中其余5只在相同時間點以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速斷頭取腦，立即取上矢狀竇旁腦組織約100mg在1‰DEPC水中稍作漂洗，立即放入高溫滅菌后EP管，液氮中保存備用提取RNA;另切取上矢狀竇中1/3竇旁腦皮層組織約100mg，用于腦組織含水量的測定。

1.4 腦組織含水量測定 干濕法測定腦組織含水量，取上矢狀竇中1/3竇旁腦皮層組織約100mg腦組織，迅速用濾紙吸除殘水，稱重后置于110℃恒溫烤箱，烘干48h至恒重，稱取干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5 VEGF免疫組化染色

1.5.1 試劑 VEGF兔源性單克隆抗體，二抗IGg(羊抗兔)試劑盒，DAB顯色試劑盒，均購于北京中杉金橋生物技術有限公司公司，其余試劑由北京大學香港科技大學醫學中心提供。

1.5.2 免疫組化實驗步驟 實驗按免疫組織化學二步法常規染色步驟進行:脫蠟，水化組織切片。3%過氧化氫孵育4min，以阻斷內源性過氧化物酶。PBS洗1次3min。滴加適當稀釋的一抗VEGF單克隆抗體(1:100)，4℃孵育24h。棄一抗，用PBS沖洗3次。滴加二抗IGg(1:200)，置室溫下孵育 20min。PBS沖洗3次。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，室溫下光鏡觀察顯色滿意后自來水沖洗5min終止顯色。常規復染，脫水，封片。用 PBS液替代一抗進行陰性對照染色。VEGF陽性細胞為胞漿呈黃色至棕黃色。圖像分析在LEICADM4000B顯微鏡下進行，每張切片于低倍鏡下從上矢狀竇周圍選取5個視野，然后在高倍鏡下計數陽性細胞數。

1.6 RT-PCR法檢測VEGF mRNA含量

1.6.1 主要試劑和儀器 Trizol(購自美國Invertrogen公司;逆轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit Perfect RealTime)、熒光定量 PCR試劑盒(SYBR Premix ExTaqTM)購自 TaKaRa公司;VEGF及GAPDH引物序列設計參照文獻［5］進行并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。Light Cycler realtime PCR擴增儀(Roche Diagnostics)由北京大學香港科技大學醫學中心實驗室提供。

1.6.2 RT-PCR檢測VEGF mRNA的表達 大鼠各期腦組織按trizol裂解液說明書中操作步驟提取RNA;總的RNA濃度通過紫外分光光度法測定其260nm和280nm吸光度比值在1.8～2.2，以提取的RNA為模板，按照逆轉錄試劑盒說明操作獲得cDNA，反轉錄反應條件:37℃，15min，85℃，5s 。進行實時(Real Time)PCR反應:按qRT-PCR試劑盒說明書在LightCycler Real Time PCR擴增儀上進行檢測。反應條件:預變性 95℃，30s，變性 95℃，5s，退火延伸60℃，20s;共40次循環;同時設計RT質控和PCR擴增2個空白對照。融解曲線分析:65℃15 s，20℃/s。反應結束后確認Real Time PCR擴增曲線和融解曲線以及分析擴增基因表達情況。VEGF引物序列:上游 5-TGCTGGGGCTGGCATTGCTC-3，下游 5-TCCTTGCTGGGCTGGGTGGT-3’;內參照 GAPDH引物序列:上游5-ACCAGCGCAGCTATTGCCGT-3下游5-GACGTGGGCACGCACTCCAG-3’。各個樣本目的基因和內參基因(GAPDH)循環閾值的差值為ΔCt，任選其中一個樣本為對照樣本，各樣本和對照樣本的Ct差值記作ΔCt目的基因相對表達量記作 2-ΔΔCt。

1.7 統計學處理 計量資料均以(χ±s)表示，采用SPSS13.0統計學軟件對數據進行處理，兩組間參數比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦組織含水量 假手術對照組各組比較無顯著性差異;與假手術對照組比較，CVST 1d、3d組腦組織含水量明顯增加有顯著性差異(P＜0.05)，CVST 7d組腦組織含水量與對照組比較無顯著性差異(p＞0.05)(見表1)。提示CVST后1d即存在明顯腦水腫，CVST 3d腦水腫明顯減輕，CVST 7d腦水腫消失。

2.2 VEGF蛋白的表達 免疫組化檢測結果顯示，假手術對照組腦組織僅少量VEGF陽性細胞(見圖2A)，CVST組各時間點上矢狀竇周圍腦組織里均發現大量VEGF免疫染色陽性細胞(見圖2B)，在CVST后1d、3d、7d有逐漸增強的趨勢，數量均明顯高于對照組(P＜0.05)(見表2)，并且在上矢狀竇周圍可見 VEGF免疫陽性著色的血管(見圖2C)。

2.3 VEGF mRNA在腦組織中的表達 RTPCR結果顯示，假手術對照組僅有少量VEGF mRNA表達。CVST后1d VEGF mRNA轉錄水平顯著升高，之后VEGF mRNA轉錄逐漸增強，CVST后7d達高峰。CVST各組VEGF mRNA轉錄水平與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。CVST后VEGF mRNA轉錄水平是一個逐漸增強的過程。見圖3。

表1 各組腦組織含水量(χ±s)

表2 各組大鼠不同時間點VEGF陽性細胞計數比較(χ±s個/視野)

圖1 a:假手術對照組大鼠MRV，上矢狀竇清晰可見(箭頭所示);b:CVST組大鼠上矢狀竇血栓形成模型建立后24h內MRV顯示上矢狀竇血流信號消失(箭頭所示)，上矢狀竇閉塞

圖2 大鼠腦組織VEGF免疫組化圖片，可見 VEGF免疫陽性著色的血管

圖3 VEGF mRNA動態變化

3 討論

VEGF在病理條件下如腦缺血時無論在mRNA水平還是在蛋白水平均有過量表達，具有促進血管內皮細胞分裂與增殖、增加微靜脈及小靜脈的通透性、誘導血管生成等功能。有研究發現，VEGF表達與組織中微血管密度及新生血管的密度密切相關，VEGF參與了局部微血管形成和血液洪應的改善［6］。本實驗結果顯示，CVST后1d即存在VEGF蛋白及 VEGF mRNA的顯著高表達，CVST后3d、7d，其表達逐漸增強。考慮可能是由于靜脈血栓形成使靜脈壓增高，降低了毛細血管灌注壓，最終減少了腦血容量，腦灌注壓和腦血流量下降，導致顱內壓增高、缺血、缺氧等病理改變，VEGF在低血氧和血管內壓升高等刺激下高表達［7，8］。

國外有學者［9］通過對光化學誘導法建立大鼠靜脈缺血模型，24h后在血管源性水腫區域觀察到了VEGF的表達，并認為大鼠靜脈血栓形成急性期VEGF的增高主要與血管源性腦水腫有關。國內研究者［10］通過影像學和病理學方法分析表觀彌散系數值與血管內皮生長因子的關系，結果發現血管內皮生長因子表達與血管源性水腫相關，在表觀彌散系數圖上表現為高信號。本實驗結果顯示，CVST后1d、3d，腦組織含水量增高，CVST 1d腦組織含水量最高，CVST 3d時有所下降，7d時恢復正常，CVST 1d后腦水腫是一個逐步減輕的過程。同時，CVST 1d、3d，VEGF無論在蛋白水平還是mRNA水平均有顯著高表達，提示急性期VEGF表達可能和腦水腫有關。可能是由于腦缺血缺氧時，VEGF增加血管通透性，通透性的增加可破壞內皮細胞間緊密連接結構，導致病變組織微血管結構破壞而血漿外滲，加重腦水腫的形成。但研究結果表明，CVST 1d腦組織含水量逐漸減少，腦水腫逐步減輕，但VEGF在蛋白水平和mRNA水平不但沒有降低，反而顯著增強，持續到CVST后7d仍有較高表達，提示CVST后期VEGF的高表達，可能與腦水腫關系不大。而VEGF不僅具有增加血管通透性作用，還有促進內皮細胞增殖作用，提示可能與促進血管新生有關。

CVST患者癥狀恢復的基本機制主要包括急性發作后靜脈竇再通和側支循環形成等，過去主要傾向于再通，臨床也常常在早期觀察到再通［11］，但進一步的研究發現靜脈竇再通或是持續的閉塞對于臨床功能預后似乎影響不大［12］，所以，CVST后側支循環的形成就顯得尤為重要［13］。血管內皮生長因子，是迄今為止已知的作用最強的促血管生長因子，其促血管生成作用已經被多個實驗所證實［14］。本實驗也顯示，CVST后VEGF無論在蛋白水平還是mRNA水平都持續高表達，并且觀察到上矢狀竇閉塞腦組織周圍可見VEGF免疫陽性著色的血管，國外Erwin Stolz等［5］研究觀察亞急性靜脈竇血栓形成大鼠CVST后新生血管等側支循環的變化，發現CVST后6w皮質靜脈的體積分數和數量顯著增加，微血管網絡連接到皮層靜脈，伴隨VEGF的強烈表達，均提示 VEGF在 CVST后可能與血管新生有關。VEGF與其受體結合，選擇性地作用于血管內皮細胞刺激其增殖，并促使內皮細胞遷移及細胞間的相互作用和管腔的形成，增加缺血組織的血管新生，從而形成新的側支循環或者有利于潛在側支通路的開放或加強，而新生血管的形成直接關系到缺血區域血液循環改善，從而具有保護神經元、促進神經干細胞增殖的作用，在一定程度上可減少神經功能的缺損［15］，從而為癥狀恢復提供有利條件。

我們的實驗結果表明，VEGF在CVST急性期表達可能與腦水腫有關，但其長期表達可能與促進血管生成、側支循環形成有關。進一步的研究需要探討影響VEGF表達的因素及其調控機制，以及CVST后新生血管等側支循環的形成過程，并進一步明確其與VEGF的相關性，對于明確其在靜脈竇血栓治療中的作用以及尋找特異性和靶向性的治療藥物具有重要意義。

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