腦組織勻漿誘導人臍帶間充質干細胞分化為神經樣細胞

王憲英 吳紅海 秦亞斌 侯艷寧 (河北醫科大學，河北 石家莊 05007)

腦組織勻漿誘導人臍帶間充質干細胞分化為神經樣細胞

王憲英 吳紅海1秦亞斌 侯艷寧1(河北醫科大學，河北 石家莊 050017)

目的 模擬體內微環境，研究人臍帶間充質干細胞(hUCMSCs)在腦組織勻漿誘導下向神經樣細胞的分化程度。方法 體外分離、培養、擴增hUCMSCs，流式細胞儀鑒定其表面抗原CD29、CD44、CD45、CD105、CD34、HLA-DR;制備大鼠腦組織勻漿與hUCMSCs共培養，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，并應用免疫細胞化學技術檢測共培養3 d后細胞內神經干細胞表面標志物巢蛋白(nestin)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達。結果 腦組織勻漿培養hUCMSCs后，細胞表達nestin、NSE及GFAP，而正常培養的hUCMSCs不表達。結論 腦組織勻漿可以誘導hUCMSCs向神經樣細胞分化。

腦組織勻漿;臍帶間充質干細胞;神經樣細胞

人臍帶間充質干細胞(hUMSCs)同骨髓間充質干細胞(MSCs)、臍帶血間充質干細胞等一樣是一類具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，其分化具有可塑性，分化方向受所處微環境的影響。有學者通過改變hUCMSCs的微環境，促進其向神經樣細胞分化以期解決神經細胞再生難題，但大多為化學方法，限制了應用于臨床的可能〔1，2〕。本研究采用體外模擬腦內微環境，將大鼠的腦組織勻漿與hUMSCs共培養，誘導hUMSCs向神經樣細胞分化，為臨床上神經創傷及神經退行性變所致神經損傷提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 動物

220 ～250 g，合格證編號：1009115。

1.2 藥品和試劑

DMEM/F12、胎牛血清(FBS)(Hyclone公司);0.25%胰蛋白酶/EDTA(Solarbio公司);鼠抗人巢蛋白(nestin)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)單克隆抗體及兔抗人膠質纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司);二抗MaxVision試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司);小鼠抗人CD105-PE單克隆抗體(eBioscience公司);小鼠抗人 CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PC5、CD34-PE 及HLA-DR-FITC單克隆抗體(Beckman Coulter公司)。

1.3 儀器

3131型水套式CO2培養箱(美國Thermo Forma公司);BX-41顯微成像系統(日本Olympus公司);XDZ-2型倒置顯微鏡(重慶精密儀器廠);超凈工作臺(北京半導體設備一廠);EPICS-XL4流式細胞儀(Beckman Coulter公司)。

1.4 方法

1.4.1 hUMSCs的分離與培養 在無菌條件下收取健康檢測合格的足月新生兒臍帶置于無菌瓶中(產婦及家屬知情同意)，

SD大鼠，由河北省實驗動物中心提供，雄性，體重PBS沖洗臍帶中殘留的血液，將臍帶剪至4～5 cm的小段，區分三根血管的位置(含兩條動脈，一條靜脈)，從血管間隙剪開臍帶，選取華爾通膠(Wharton膠)，剪碎至1 mm3大小，置于75 cm2培養瓶中，加入培養基置于37℃，體積分數為5%的CO2培養箱中培養。1 w后首次換液，棄去未貼壁細胞，之后每3～4天換液一次。倒置顯微鏡下觀察，待細胞生長至80% ～90%融合后，用0.25%胰酶/EDTA混合消化液消化，按1∶3傳代。

1.4.2 流式細胞學鑒定細胞表面標志物 取生長狀態良好的P3代hUMSCs，消化后用PBS清洗3次，進行細胞計數，調整細胞密度，使每管樣品中細胞密度為5×105個/100 μl，分為A、B、C管，A樣品中加入HLA-DR-FITC、CD34-PE和 CD45-PC5單克隆抗體，B樣品中加入CD29-FITC和CD105-PE單克隆抗體，C樣品中加入CD44-FITC單克隆抗體，同時每管樣品設立同型陰性對照。4℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，應用流式細胞儀進行分析。

1.4.3 大鼠腦組織勻漿的提取〔3〕大鼠斷頭取出腦組織，置于冰上，稱取濕重，按150 g/L加入DMEM/F12培養基，用勻漿器將腦組織勻漿，離心后吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后儲存于-80℃冰箱中備用。

1.4.4 腦組織勻漿誘導hUMSCs分化 將培養的第3代hUMSCs制成單細胞懸液，以1×105/ml的細胞密度接種于24孔板中，制備細胞爬片，孔內預先鋪有經多聚賴氨酸處理的蓋玻片，待細胞貼壁伸展后加入誘導液，并以正常培養的細胞作對照。倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。于培養后的第3天，取出蓋玻片進行免疫細胞化學染色鑒定nestin，NSE及GFAP的表達。

1.4.5 分化細胞的鑒定 吸棄24孔板中的培養液，取細胞爬片，PBS沖洗3次，每次3 min，4%多聚甲醛固定30 min。過氧化氫室溫孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗;滴加一抗工作液(nestin、NSE、GFAP，1∶50 稀釋)室溫放置1 h后置4℃冰箱過夜，PBS沖洗;滴加MaxVision二抗工作液，室溫孵育15 min，PBS沖洗;DAB顯色;蘇木精復染，自來水沖洗;1%鹽酸酒精分色;1%氨水中和;梯度酒精脫水干燥;二甲苯透明;中性樹膠封片。

2 結果

2.1 hUMSCs表面抗原鑒定

經流式細胞儀檢測高度表達間質細胞標志CD44、CD29和 CD105，其陽性率分別為86.0%、95.2%、93.0%，不表達造血細胞標志CD45、CD34以及人白細胞表面抗原HLA-DR，其陽性率分別為4.7%、3.8%、0.7%。

2.2 正常培養hUMSCs的增殖及形態特征

原代培養約1 w后可見大量圓形透亮細胞及貼壁生長的成纖維樣細胞。首次換液后，細胞團塊增值較快，以集落形式生長為主，10 d左右細胞達到80%～90%融合，主要以紡錘形細胞為主。傳代后細胞生長更加迅速，24 h內即可完全貼壁，5～7 d即可達到80% ～90%融合，細胞形態均一，整體呈漩渦狀，輻射狀排列。見圖1A。

2.3 腦組織勻漿培養對hUMSCs形態的影響

hUMSCs經腦組織勻漿培養24小時后，細胞形態即發生變化，細胞質向核收縮，胞體變小，呈不規則形或圓形。培養第3天，部分細胞可見兩個或多個突起伸出，類似神經細胞，有的呈簡單的雙極或多極。3 d后細胞形態不再發生明顯變化，見圖1B。正常培養細胞未見細胞形態明顯變化。

2.4 腦組織勻漿培養hUMSCs后其神經樣細胞表面標志物的表達腦勻漿培養的hUMSCs經免疫細胞化學染色后在鏡下可觀察到：部分細胞分別呈nestin、NSE及GFAP陽性表達(細胞質呈黃色或棕黃色著色)，見圖2，正常培養的細胞未見表達。

圖1 hUMSCs形態變化(×100)

圖2 誘導后部分細胞nestin、NSE、GFAP免疫表達(DAB，×400)

3 討論

目前，在實驗和臨床研究中間充質干細胞的主要來源是骨髓和臍血，但均存在其自身局限性。含量很低而且細胞數量及增殖分化潛能隨供著年齡的增大而下降，且骨髓的采集給供者帶來痛苦，同時還存在著病毒污染的可能，因此來源受到限制。臍血來源充足，但分辨率較低，而且臍血間充質細胞所占的比例遠較骨髓低〔4，5〕，限制了其在組織工程和細胞治療中的廣泛應用。臍帶作為分離培養MSCs的取材來源，具有采集方便，免疫原性低，病毒污染率低，不涉及社會、法律及倫理方面爭議等優點，同時研究表明臍帶中干細胞的含量遠遠高于骨髓中的含量〔6，7〕，因此，hUMSCs成為組織工程和細胞治療中更為理想的種子細胞。

干細胞所處的微環境決定了其增殖、分化的進程及方向〔8，9〕。國內外一些學者應用組織勻漿模擬體內局部微環境誘導間充質干細胞向特定方向分化〔10～13〕。間充質干細胞在腦組織勻漿培養條件下可向神經樣細胞分化，同時分化方向正像一些學者所提出的MSCs是先分化為神經干細胞再向神經元樣細胞或星型膠質細胞分化〔14〕。腦組織勻漿液中含有多種生長因子、神經營養因子、神經遞質及神經甾體等活性物質，如堿性成纖維細胞生長因子、腦源性神經營養因子、肝細胞因子及谷氨酸、甘氨酸等等，他們通過獨自或相互作用刺激干細胞向神經樣細胞分化〔15，16〕。

近年來，干細胞研究方興未艾，如何在體內使其分化為目的細胞適應臨床需要是大家研究的重點。我們模擬機體微環境使間充質干細胞自發向神經樣細胞分化，為其應用于臨床治療神經細胞損傷、神經退行性疾病如帕金森病、老年癡呆等提供了理論依據。

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R329.24 〔

A

1005-9202(2012)07-1439-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.07.053

1 中國人民解放軍白求恩國際和平醫院

侯艷寧(1957-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事神經及臨床藥理學研究。

王憲英(1973-)，女，在讀博士，副主任藥師，主要從事神經藥理學研究。

〔2011-05-20收稿 2011-10-12修回〕

(編輯 曹夢園)