鋅指蛋白185通過與肌動蛋白纖維結合抑制腫瘤細胞增殖

鄭全輝 陸 斌 葛淑芝 張愛紅 (河北聯合大學基礎醫學院，河北 唐山 063000)

鋅指蛋白(ZNF)185是一種c端含有LIM結構域的蛋白，由于mRNA的選擇性剪切和轉錄/翻譯起始位點的差異，ZNF185編碼多個不同的蛋白剪切體。ZNF185在人體多種組織表達，尤以骨髓和前列腺表達最高〔1〕。近年來研究發現，ZNF185基因參與肌動蛋白(actin)共定位，并在腫瘤組織中表達下調〔2，3〕。本課題組前期發現在前列腺癌細胞中，ZNF185的表達顯著降低，然而，對于ZNF185不同蛋白剪切體在前列腺癌細胞增殖中的作用少見報道。本文擬觀察ZNF185不同蛋白剪切體與actin結合，并檢測ZNF185不同蛋白剪切體對前列腺癌細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常前列腺組織取自唐山工人醫院，人前列腺癌細胞系DU145、LNCaP、PWPE2由本實驗室凍存。TRIzol試劑盒、Lipofactamine2000購自Invitrogen公司;各種限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶和反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司;質粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自 Axygen公司;兔抗人ZNF185一抗、兔抗人actin一抗和pEGFPC2綠色熒光蛋白表達質粒由中科院動物所趙勇研究員提供;HRP羊抗兔二抗和Phalloidin-TRITC(羅丹明標記的鬼筆環肽)購自北京博奧森公司;蛋白提取試劑盒和Bio-Rad蛋白濃度測定試劑盒購自北京天恩澤公司，引物由上海生物工程服務公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Western印跡 提取組織或細胞總蛋白，測定蛋白濃度。各取10 μg進行SDS-PAGE膠電泳。電泳后將蛋白電轉(4℃，恒流300 mA，2 h)到硝酸纖維素膜(NC)上，然后將NC膜在含100 g/L脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h，加兔抗人ZNF185一抗(1∶1 000)4℃過夜，TBST洗去未結合的一抗，再加HRP羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫作用1 h，TBST沖洗后加底物反應3 min，暗室曝光。

1.2.2 ZNF185 CDNA克隆 正常前列腺組織總RNA提取和反轉錄按照試劑盒說明書進行。PCR采用Pfx高保真DNA聚合酶和下列引物：上游：5'-GGAATTCATGAGTATCTCAGCTCTTG-3'，下 游：5'-ACGCGTCGACTAGAAGAGCTTCTCATAGC-3'。上、下游引物分別加入EcoR I/Sal I酶切位點。反應條件：94℃2 min，然后 94℃30 s，58℃45 s，72℃延伸 1 min;30 個循環，最后72℃孵育10 min，PCR產物膠回收并純化。EcoR I/Sal I雙酶切PCR產物和pEGFPC2質粒，回收純化酶切產物，并利用T4 DNA連接酶將其連接在一起。轉化，挑克隆進行序列測定。

1.2.3 細胞培養和轉染 人前列腺癌細胞系DU145采用RPMI-1640培養基，5%胎牛血清常規培養。質粒轉染采用Lipofactamine2000，按操作說明進行。為獲得穩定轉染ZNF185不同蛋白剪切體的細胞，DU145在轉染24 h后，1∶2分離培養過夜，加入G418(600 mg/ml)篩選抗性克隆。選擇培養2個月后，采用流式細胞儀分選綠色熒光蛋白陽性細胞，常規培養。

1.2.4 免疫熒光染色 在涂布纖維黏連蛋白(10 mg/ml)的玻片上培養ZNF185不同蛋白剪切體轉染細胞，PBS沖洗，4%多聚甲醛中固定20 min，然后用0.1%Triton X-100/PBS透膜5 min。采用Phalloidin-TRITC(1∶40)標記actin纖維。LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察ZNF185蛋白剪切體與actin纖維的共定位。

1.2.5 細胞增殖檢測 分別取 ZNF185(689aa)、ZNF185(452aa)和pEGFP2載體穩定轉染細胞接種96孔板(2×104/孔)，每個樣品3個復孔。每隔24 h收取細胞，臺盤藍染色計數，計算均數和標準差。連續計數6 d，繪制增殖曲線。

2 結果

2.1 ZNF185在前列腺癌細胞中表達顯著降低 Western印跡檢測人正常前列腺組織和不同前列腺癌細胞 LNCaP，DU145，PWPE2中ZNF185的表達，發現ZNF185在正常前列腺組織高表達，而在檢測的前列腺癌細胞中，ZNF185的表達顯著降低。見圖1。

2.2 ZNF185蛋白剪切體克隆 從正常前列腺組織提取RNA，反轉錄擴增，擴增產物克隆至pEGFPC2載體，測序分析表明，克隆 cDNA主要編碼兩種多肽：一種為689aa多肽，包含ZNF185全長編碼序列，其羧基端含有兩個鋅指結構(zinc-finger motif)組成的LIM結構域，氨基端為actin骨架結合結構域(ATD);另一種為452aa的多肽，除不含氨基端ATD結構域外，其他序列與全長ZNF185編碼序列相同。見圖2。

2.3 全長ZNF185結合actin纖維 分別將編碼689aa和452aa的ZNF185-pEGFPC2質粒轉染前列腺癌細胞系DU145，采用激光共聚焦顯微鏡觀察不同ZNF185蛋白剪切體的細胞定位和與actin纖維的結合。ZNF185-EGFPC2編碼蛋白由于帶有綠色熒光蛋白(GFP)顯綠色，actin熒光抗體受激發顯紅色。從圖3可以看出，全長ZNF185蛋白主要分布在細胞質，并與actin纖維染色完全重合，而編碼452aa的ZNF185蛋白在細胞核和細胞質均有分布，但由于缺乏ATD結構域不與actin纖維結合。

圖1 Western印跡檢測ZNF185的表達

圖2 ZNF185蛋白剪切體克隆

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測452aa和689aa ZNF185與細胞actin骨架共定位

2.4 全長ZNF185抑制前列腺癌細胞的增殖 與正常前列腺組織相比，ZNF185在前列腺癌細胞中表達顯著降低，提示ZNF185可能調控前列腺癌細胞的增殖。為此，本文分別將689aa和452aa的ZNF185-pEGFPC2質粒轉染DU145，經G418篩選后獲得穩定轉染細胞株，Western印跡檢測所得DU145細胞分別高表達全長ZNF185(689aa)和N端缺失ATD結構域的ZNF185(452aa)(圖 4A)。分別將空載體，689aa和 452aa ZNF185-pEGFPC2穩定轉染的DU145細胞接種96孔板，結果顯示，表達ZNF185全長序列689aa的DU145與轉染空載體pEGFPC2的對照組細胞相比，細胞增殖速率顯著減低;而轉染編碼452aa ZNF185質粒的DU145細胞，增殖速率與對照組相比沒有差異(圖4B)。

圖4 全長ZNF185抑制DU145細胞增殖

3 討論

LIM蛋白是一類進化保守的蛋白家族，因其序列中包含LIM(Lin-1，Isl-1，Mec-3)結構域而得名。ZNF185蛋白屬于第三組LIM結構域蛋白，首先由Heiss等通過定位克隆的方法得到，其基因定位于X染色體長臂2區8帶(Xq28)DXS52區域。基于表達序列標簽(EST)和基因組序列分析，ZNF185 cDNA編碼一個452aa的蛋白，在其 C端有一個 LIM結構域，并推測ZNF185可能與細胞增殖和分化有關〔1〕。

2006年，Zhang等〔4〕從正常人前列腺癌組織中通過克隆測序，得到ZNF185全長cDNA。ZNF185全長cDNA編碼蛋白比Heiss等克隆到的ZNF185分子在N端長出135個氨基酸，而且這段長出來的序列可以與actin相結合，被定義為ATD結構域。同時該研究也發現ZNF185編碼基因包含24個外顯子，由于不同外顯子剪切，ZNF185基因至少編碼4個不同氨基酸序列的蛋白產物，分別為：721aa、689aa、660aa 和 452aa，Heiss等公布的序列只是其中之一。721aa、689aa、660aa ZNF185包含多個蛋白-蛋白相互作用結構域，如：PDZ(Postsynaptic density-95，Discs large，zonaoccludens-1)、LD(Leucine-aspartate repeat)和 ATD 結構域;而452aa ZNF185缺少ATD結構域，提示可能與其他ZNF185蛋白剪切體存在功能差異。

ZNF185在人多種組織表達，前列腺組織表達最高，骨髓、外周血、甲狀腺、腦、腎等組織也有較高表達，而在前列腺癌細胞中，ZNF185表達顯著降低，這與Vanaja等〔5〕的結果一致。然而，ZNF185表達多個不同的蛋白剪切體，它們在前列腺細胞中的功能差異目前尚無報道。因此，我們克隆了689aa和452aa的ZNF185編碼序列。熒光共定位研究顯示只有689aa ZNF185與細胞actin骨架結合，與這兩個ZNF185蛋白剪切體的結構域差異相符。有意思的是，452aa ZNF185不能抑制前列腺癌細胞的增殖，而只有包含ATD結構域的689aa ZNF185能夠顯著抑制前列腺癌細胞的增殖。此結果表明，ZNF18與細胞actin骨架的結合是其發揮抑癌作用的關鍵。目前，細胞蛋白骨架成分表達和功能改變與腫瘤發生和發展的關系是腫瘤研究的一個亮點〔6〕，本研究結果為此領域的研究提供了新的線索。值得注意的是，452aa ZNF185在前列腺癌細胞中的表達也顯著降低。因此，此蛋白剪切體在正常前列腺細胞中的功能尚需進一步探討。

1 Heiss NS，Gloeckner G，Bachner D，et al.Genomic structure of a novel LIM domain gene(ZNF185)in Xq28 and comparisons with the orthologous murine transcript〔J〕.Genomics，1997;43(3)：329-38.

2 Rabbitts TH，Boehm T.LIM domains〔J〕.Nature，1990;346(6283)：418.

3 Sanchez-Garcia I，Rabbitts T.The LIM domains：a new structural motif found in zinc-finger-like protein〔J〕.Trends Genet，1994;10(9)：315-20.

4 Zhang JS，Gong A，Young CY.ZNF185，an actin-cytoskeleton-associated growth inhibitory LIM protein in prostate cancer〔J〕.Oncogene，2007;26(1)：111-22.

5 Vanaja DK，Cheville JC，Iturria SJ，et al.Transcriptional silencing of zinc finger protein 185 identified by expression profiling is associated with prostate cancer progression〔J〕.Cancer Res，2003;63(14)：3877-82.

6 Yamaguchi H，Condeelis J.Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion〔J〕.Biochim Biophys Acta，2007;1773(5)：642-52.