微矩陣電極在人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞上的應(yīng)用

盧珺 Heming Wei張廣欽

微矩陣電極系統(tǒng)(Multielectrode array，MEA)是一個進(jìn)行體外實驗的簡易且具有創(chuàng)新意義的研究工具。其包括數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，MEA信號放大器和溫控系統(tǒng)，MEA信號放大器的核心部件含有60個鈦金微電極。通過MEA信號放大器可記錄到細(xì)胞及組織(心肌，腦片和肌肉)的電生理信號。數(shù)據(jù)可由內(nèi)置軟件計算分析。

自MEA問世30多年以來，相關(guān)的技術(shù)不斷改進(jìn)。因其高效快捷的特點，MEA技術(shù)受到越來越多研究者的重視。其應(yīng)用范圍從最初的腦片擴(kuò)展到到體外培養(yǎng)的細(xì)胞以及多功能干細(xì)胞，如小鼠和人類的胚胎干細(xì)胞 (Embryonic stem cells，ESC)以及誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞或者心肌細(xì)胞。多功能干細(xì)胞分化的心肌和神經(jīng)細(xì)胞可反映人類在體細(xì)胞的生理特性，故可作為有價值的體外(細(xì)胞)疾病模型和藥物篩選工具，甚至自體細(xì)胞治療。目前，包括抗心律失常藥在內(nèi)的許多心血管藥物都作用于不同的離子通道。然而，抗心律失常藥同樣會導(dǎo)致心律失常的副作用［1］。諸如小鼠等動物模型被應(yīng)用于研究遺傳型心律失常患者的基因突變的功能性改變。但因為小鼠與人類在心肌上離子通道的類型和分布存在差異，且小鼠動作電位時程更短，心律更快(=600bpm)，因此小鼠模型不能顯現(xiàn)出與人類相同的表現(xiàn)型［2］。2007年，科學(xué)家利用 c-Myc，Oct3/4，SOX2，Klf4這4種轉(zhuǎn)錄因子組合或者Oct-4，Sox2，Nanog，Lin 28將人的體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞［3，4］。iPS的問世，為藥物開發(fā)的早期工作中，特別是對藥理、代謝和毒性評價提供了人類各種細(xì)胞的生理模型。MEA系統(tǒng)作為一個簡單新穎的實驗工具，可對iPS分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行長期的體外研究。其具有簡單高效的優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于離子通道藥物篩選和基礎(chǔ)研究。本實驗將hiPSC-CMs與MEA系統(tǒng)的有機結(jié)合，可直接評估心血管藥物的有效性。從長遠(yuǎn)考慮，我們的模型可用于個體化用藥研究，并有利于檢測心血管藥物的安全性和有效性。

本文旨在探討應(yīng)用MEA系統(tǒng)研究人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞電生理特性，并建立穩(wěn)定高效的心血管藥物篩選平臺。本文主要探討MEA技術(shù)在人類誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 MEA系統(tǒng)儀器與軟件 儀器:微矩陣電極系統(tǒng)(MultichannelSystems，Reutlingen，Germany)。微矩陣電極芯片(MultichannelSystems，Reutlingen，Germany)60個鈦金微電極(30 μm)，電極間距為200 μm。溫度控制系統(tǒng)(MultichannelSystems，Reutlingen，Germany)。軟件:MC_Rack采集分析軟件(Multichannel Systems)。

1.2 細(xì)胞和培養(yǎng)基 人類誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞(新加坡國家心臟中心提供)。培養(yǎng)基:低糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%胎牛血清 +1%谷氨酰胺+1%青霉素+1%鏈霉素(Sigma公司購買)。其他材料:0.1% 明膠。

1.3 方法

1.3.1 微矩陣電極芯片的清洗和處理 實驗前，將微矩陣電極芯片浸泡于75% 酒精2 h，擦干后置于超凈臺，紫外光照射20 min，備用。

1.3.2 心肌細(xì)胞團(tuán)選擇與轉(zhuǎn)移 顯微操作下，選擇節(jié)律性跳動，強力收縮，心律為30～60/min，且直徑在500 μm以上iPS分化的心肌細(xì)胞團(tuán)為操作對象，將其切割下來，并置于0.1% 明膠處理的MEA芯片上，確保心肌細(xì)胞團(tuán)置于并覆蓋在微電極表面。(圖1和圖2)。小心地加入細(xì)胞培養(yǎng)基。將芯片置于直徑為100毫米的細(xì)胞培養(yǎng)皿中并放入37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。

圖1 微矩陣電極

1.3.3 實驗記錄 至細(xì)胞團(tuán)穩(wěn)定貼附于MEA芯片后，啟動加熱系統(tǒng)，調(diào)節(jié)溫度至37℃。將微矩陣電極芯片放入微矩陣記錄系統(tǒng)，打開MC_Rack采集分析軟件，開始采集心肌細(xì)胞電生理信號。待場電位信號穩(wěn)定后，開始記錄，記錄時間為180 s，整個實驗在37℃下進(jìn)行，心肌細(xì)胞團(tuán)維持在培養(yǎng)基中。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用MC_Rack分析軟件對記錄到的hiPSC-CMs的場電位(FPD)和心率進(jìn)行分析，利用Bazzet公式cFPD=FPD/√(RR interval)計算場電位時程。

2 結(jié)果

2.1 人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞培養(yǎng)與電生理記錄本實驗成功將分化的心肌細(xì)胞團(tuán)貼附于微矩陣電極芯片，并保持節(jié)律性跳動，為進(jìn)行長時間的心血管藥物篩選和基礎(chǔ)研究提供了保障。該實驗成功記錄到人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞的場電位。由于心肌細(xì)胞團(tuán)的大小和所處的位置不同，并非所有微電極都可檢測到電信號，圖3為60個電極分別記錄的細(xì)胞團(tuán)體外電信號的變化。

圖2 人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞

圖3 60個電極記錄的心肌細(xì)胞場電位

圖4 TTX對iPS心肌細(xì)胞的影響

2.2 河豚毒素(TTX)對人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞 場電位的影響 由圖4可見，場電位含有快速去極化下降支，平臺期和復(fù)極相。河豚毒素為Na+通道特異性阻斷劑，10 M的TTX降低心率，并阻斷Na+電流，縮短FP min的幅度(圖 5a，b)。

圖5

3 討論

人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞形成的體外模型與MEA系統(tǒng)相結(jié)合可作為臨床高效安全的心血管藥物篩選平臺。本實驗旨在通過應(yīng)用MEA系統(tǒng)研究人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞電生理特性，并建立穩(wěn)定高效的心血管藥物篩選平臺。

為證明MEA系統(tǒng)是否可作為理想的心血管藥物篩選工具，我們以人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞團(tuán)作為體外試驗的對象，將其貼于微矩陣電極芯片，記錄心肌細(xì)胞的電生理信號以及藥物反應(yīng)，研究心肌細(xì)胞場電位和心率。本實驗記錄到的電生理信號與人類胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞相似，并保持節(jié)律性跳動，從而可進(jìn)行長時間的心血管藥物篩選測試和基礎(chǔ)研究。

文獻(xiàn)報道場電位時程與動作電位時程存在線性關(guān)系［5］。此外，場電位快速負(fù)偏倚與Na+通道活動有關(guān)，F(xiàn)Pslow反映的是動作電位平臺期L型Ca2+通道的活動［5，6］。因此，依據(jù)其良好的時間空間分辨率，MEA系統(tǒng)可用于研究類似于動作電位的場電位特性。

不同心血管藥物可作用于不同的離子通道，動作電位的去極化是由于大量的鈉通道開放引起的鈉離子大量、快速內(nèi)流所致。河豚毒素(TTX)作為鈉通道阻斷劑，可阻斷鈉離子活動。實驗結(jié)果顯示心肌細(xì)胞團(tuán)經(jīng)10 M的TTX處理過后，心率降低，F(xiàn)P min明顯縮短。證明MEA系統(tǒng)可用于藥物對心肌細(xì)胞電生理特性的研究。

同胚胎干細(xì)胞一樣，小鼠iPS細(xì)胞和人類iPS細(xì)胞均可以分化成心肌細(xì)胞［7-9］。解決了由于缺少人自身的細(xì)胞模型而造成的藥物檢測程序費時費力，價格昂貴，效率低下和不準(zhǔn)確等不良因素。Moretti等［10］成功的從LQT患者的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS并定向分化成心肌細(xì)胞，重現(xiàn)了心電圖所觀察的QT間期的延長。人類胚胎干細(xì)胞和人類誘導(dǎo)的多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞(hESC-CMs和hiPSC-CMs)均可用于對心臟毒性篩選的研究［11］。而且，心血管藥物直接作用于患者自身的hiPSC-CMs更具有臨床意義［12-13］。MEA系統(tǒng)可成功記錄心肌細(xì)胞的電生理信號并可評價藥物對心肌細(xì)胞的作用，有利于在藥物研發(fā)過程中評價劑量依賴性和不良反應(yīng)的關(guān)系［14］。

在實驗過程中，需注意以下三點:①選擇心肌細(xì)胞團(tuán)時，以節(jié)律性強力收縮，心律在0.5～1 Hz范圍，且直徑在500 μm以上的心肌細(xì)胞為宜。在切割心肌細(xì)胞團(tuán)時可適當(dāng)切取心肌細(xì)胞團(tuán)周圍的成纖維細(xì)胞，有利于心肌細(xì)胞團(tuán)貼附于MEA芯片。②因為在培養(yǎng)過程中，由于心肌細(xì)胞團(tuán)的強力自發(fā)跳動，會出現(xiàn)移位現(xiàn)象，而導(dǎo)致電極不能檢測到電信號。故hiPSC-CMs必需穩(wěn)定的覆蓋于MEA芯片電極表面，確保電極可采取到新信號。③在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時，須利用Bazzet公式cFPD=FPD/√(RR interval)計算場電位時程，排除心率對場電位時程的干擾。

本實驗以人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞為研究對象，應(yīng)用MEA系統(tǒng)記錄細(xì)胞外電生理特性。在證實MEA系統(tǒng)可用于長期的體外模型實驗，并為因缺乏適合的疾病模型而導(dǎo)致的生理病理研究鋪平道路。其次，與一般急性分離的心肌細(xì)胞相比，多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞可長時期培養(yǎng)，有利于研究者進(jìn)行短期或長期研究。hPSC-CMs培養(yǎng)于微矩陣電極芯片上可進(jìn)行多次反復(fù)的檢測。另外，MEA系統(tǒng)具有操作簡單，高效快速的特點，在未來的臨床研究中，作為高通量心血管藥物臨床篩選工具進(jìn)行大規(guī)模的藥物試驗研究。

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