小鼠FGF-21 siRNA腺病毒載體的構建與鑒定

楊小敏 楊剛毅 李 伶 胡文靜 葉 菲

(重慶醫科大學檢驗醫學院臨床生化教研室 教育部實驗診斷重點實驗室，重慶 400016)

小鼠FGF-21 siRNA腺病毒載體的構建與鑒定

楊小敏 楊剛毅1李 伶 胡文靜1葉 菲1

(重慶醫科大學檢驗醫學院臨床生化教研室 教育部實驗診斷重點實驗室，重慶 400016)

目的 構建含FGF-21 siRNA基因的重組腺病毒載體并鑒定。方法 首先用BamHⅠ+HindⅢ雙酶切本課題組前期構建的質粒pSilencer1.0-shFGF-21，得到0.3 bp的目的片段，并將目的片段亞克隆入穿梭質粒(pShuttle-shFGF-21，)，用I-CeuI和I-SceI雙酶切處理pAdxsi組腺病載體及pShuttle-shFGF-21，連接，轉化DH5α感受態細胞，篩選、鑒定、測序后，最后在293細胞內包裝擴增為重組腺病毒。結果 設計并構建了小鼠FGF-21基因特異性siRNA腺病毒載體，并經酶切和測序鑒定。空斑形成實驗測得腺病毒滴度為1×1010PFU/ml。結論 成功構建了小鼠FGF-21基因特異性siRNA腺病毒載體。

RNA干擾;腺病毒載體;FGF-21;脂聯素

成纖維細胞生長因子-21(FGF-21)是一種主要來源于肝臟和脂肪組織的細胞因子，肝、脂肪及胰腺是其主要外周靶組織。FGF-21具有降低肥胖和糖尿病動物血糖、胰島素和血脂水平，保護胰島β細胞，調節糖脂代謝等功能。在肝臟中，FGF-21促進游離脂肪酸(FFA)氧化并生成酮體。而在脂肪細胞中，FGF-21 刺激脂肪細胞分解，生成甘油三酯(TG)〔1，2〕。因此，FGF-21是繼瘦素和脂聯素發現之后又一個與胰島素抵抗(IR)有關的細胞因子。目前的研究結果尚不能完全闡明FGF-21的確切作用機制。為此，我們構建了小鼠FGF-21 siRNA重組腺病毒載體，旨在為進一步研究其生理功能構建一個分子生物學平臺。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

攜帶脂聯素siRNA的質粒pSilencer1.0-shFGF-21和RNA干擾陰性對照質粒 pSilencer1.0-shGFP由本課題組前期構建〔3〕。穿梭質粒pShuttle和pAdxsi腺病毒載體系統由諾賽基因公司提供。限制性內切酶(NEB公司);T4 DNA連接酶(晶美生物公司);CIP酶(promega公司);dNTPs(上海生工);DNA Marker DL2000(大連寶生物公司);質粒抽提純化試劑盒、膠回收試劑盒(威格拉斯生物技術公司);DMEM(Hyclone公司);Lipofectamine 2000(美國Gibco公司);DH5α、HEK293細胞為本課題組留存;胎牛血清、胰酶(Hyclone公司)。卡那霉素、酶解酪蛋白、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、胰島素、地塞米松(DEX)(Sigma公司);序列分析(上海鼎安生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 FGF-21-siRNA穿梭質粒的構建 用BamHⅠ/HindⅢ酶切pSilencer1.0-shFGF-21和pSilencer1.0-shGFP以及穿梭質粒 pShuttle，膠回收 shFGF-21 cDNA(0.3 kb)和 pShuttle(4.2 kb)片段，用T4 DNA連接酶22℃連接4h，轉化DH5α感受態細胞，經LB卡那霉素抗性平板篩選陽性菌落后，小量抽提質粒，酶切并測序鑒定陽性克隆，得到的重組子命名為pShuttleshFGF-21和 pShuttle-GFP。

1.2.2 重組腺病毒載體的構建 用I-CeuⅠ和I-SceⅠ雙酶切處理pAdxsi載體及穿梭質粒(pShuttle-shFGF-21和 pShuttle-GFP)，回收載體及含目的基因片段，用T4 DNA連接酶連接，轉化DH5α感受態細胞，涂布到氨芐抗性固體培養基培養，挑取若干陽性菌落，接種到氨芐抗性液體培養基中培養過夜，小量抽提質粒，酶切并測序鑒定陽性克隆，得到的重組子命名為pAd-shFGF-21和pAd-GFP。將對數生長期的菌液加入LB卡那霉素抗性培養基中，37℃ 300 r/min震蕩搖菌過夜，大量提取質粒，并用PacⅠ酶切腺病毒質粒使其線性化。

1.2.3 重組腺病毒的包裝、擴增及滴度測定 用含10%FBS的DMEM高糖培養基培養HEK293細胞，按5×105/孔接種于無菌六孔板中，5%CO2，37℃飽和濕度條件下培養過夜。轉染當天換用新鮮的含10%FBS的DMEM培養基繼續培養，待細胞生長至底面積的80% ～90%時，取用Lipofectamine 2000進行轉染。2～3 d出現細胞病變反應(CPE)后，收集病毒。腺病毒滴度測定采用空斑形成實驗：將HEK293細胞接種于96孔板上，待細胞達到80%～90%融合時，加入不同倍數稀釋的病毒上清100 μl，50 ml/L CO2，37℃ 飽和濕度條件下培養 10 d后，加入中性紅溶液，37℃培養2 h后統計空斑數量，根據病毒滴度=空斑數量/稀釋因子×病毒稀釋液體積，計算病毒滴度。

2 結果

2.1 FGF-21-siRNA穿梭質粒的構建

pShuttle-shFGF-21和pShuttle-GFP質粒DNA經BamHⅠ/HindⅢ酶切后，得到酶切條帶為0.3 kb和4.2 kb的兩個片段，分別代表pShuttle質粒和插入目的片斷，與預期結果一致，說明FGF-21-siRNA表達框已正確地克隆到pShuttle載體上(圖1)。DNA序列分析也進一步證實了FGF-21-siRNA表達框的正確插入。

2.2 重組腺病毒載體的構建

重組腺病毒質粒DNA(pAdshFGF-21和pAd-GFP)經XhoI酶切后，得到6個片段，與預期結果一致(圖2)。

圖1 穿梭質粒pShuttle-shFGF-21和pShuttle-GFP酶切鑒定

圖2 重組腺病毒載體pAd-shFGF-21和pAd-GFP的酶切鑒定

2.3 重組腺病毒的包裝和擴增及滴度測定

HEK293細胞經腺病毒質粒轉染2 d后，即出現細胞變大變圓，折光性增強，出現串珠樣改變，并從細胞培養板上脫落。正常HEK293細胞未見上述變化(圖3)。空斑形成實驗測得腺病毒滴度為1×1010PFU/ml。

圖3 腺病毒質粒轉染HEK293細胞的細胞病變(CPE)

3 討論

人類在后基因組時代面臨的主要挑戰是解讀大量編碼基因的功能并研究基因調控的分子機制。基因打靶和基因剔除技術被公認為是研究基因功能和作用機制的金標準。然而，它也存在著一些不足之處，如動物模型建立周期長，技術難度高且耗資巨大。同時，不能實現定時、定位的基因表達變化，并存在胚胎性致死和不育的可能等。這種缺陷對研究2型糖尿病(T2DM)、心血管疾病等后天性疾病極為不利。RNAi技術是分子生物學中繼單克隆抗體技術、基因重組和基因剔除等重大發明之后，新發展起來的分子生物學高科技手段。作為新興的基因阻斷技術，RNAi已成為后基因組時代研究基因功能和疾病的分子生物學機制，以及基因治療的最直接和最有效的方法。它不同于傳統的在DNA水平的基因敲除，而是通過RNA干涉，實現轉錄后的基因沉默，即在mRNA水平達到基因敲除的效果。因此，在基因功能研究上有其獨特的優點，如整個流程設計簡便，且作用迅速，效果明顯，使大量基因功能可以快速經濟地進行檢測，并能實現基因的定時表達缺陷〔4，5〕，這對于研究有遺傳和環境因素共同參與疾病的發病機制具有重要意義。

在前期研究中，根據 siRNAs的設計原則〔6，7〕，我們設計了3個編碼小鼠FGF-21基因的特異性siRNA寡核苷酸插入片段，利用pSilencer1.0-U6載體構建了3個相應的表達質粒，將上述表達質粒轉染入誘導分化后的3T3-L1脂肪細胞，篩選出一條抑制FGF-21表達最有效siRNA寡核苷酸片段，將其質粒載體命名為pSilencer1.0-shFGF-21〔3〕。在此基礎上，本研究用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切上述質粒，將其亞克隆入穿梭質粒pShuttle，用I-CeuI和I-SceI酶切線性化穿梭質粒，并與骨架質粒pAdxsi載體同源重組，最后在HEK293細胞內包裝為重組腺病毒。

本研究所用pAdxsi腺病毒載體系統是目前基因治療中應用最廣泛的一種載體系統之一，具有許多優點，如轉染效率高，感染的宿主范圍廣，可以有效地轉染分裂和靜止期細胞，載體容量大，插入外源基因片段長，目的基因的蛋白在哺乳動物細胞中的表達水平較高，而且攜帶基因不整合到宿主細胞基因組中，對機體的安全性較高〔8〕。本研究中，我們先將腺病毒質粒載體轉化大腸桿菌，再將獲得的轉化細菌制成感受態細胞，作為重組穿梭質粒載體轉化宿主菌，大大提高了同源重組的效率，在空斑形成實驗中測定到了較高的病毒滴度。本研究中酶切、電泳圖譜和測序分析表明重組腺病毒質粒DNA(pAd-shFGF-21)的構建是成功的。

FGF-21是新近發現的與胰島素抵抗和T2DM具有重要關聯的細胞因子。盡管已有FGF-21基因剔除小鼠的文獻報道，但這種基因表達“全和無”式的模式，并不能真實反映人類胰島素抵抗和T2DM的特征。人類胰島素抵抗和T2DM是后天性疾病，基因缺陷表現為低水平的表達而非無表達。因此，利用RNAi技術產生的基因表達的部分抑制更有利于展現人類胰島素抵抗和T2DM的病理生理特征。本研究構建的重組腺病毒載體pAd-shFGF-21為在胰島素抵抗狀態下，在體內研究FGF-21的生理功能提供了一個重要的分子生物學技術平臺。

1 Badman MK，Pissios P，Kennedy AR，et al.Hepatic fibroblast growth factor 21 is regulated by PPARalpha and is a key mediator of hepatic lipid metabolism in ketotic states〔J〕.Cell Metab，2007;5(6)：426-37.

2 Sun XG，Song G，Liu JH，et al.Construction of plasmid vector with Tat and its ability to transducer fusion protein into cells〔J〕.Chin J Biochem Mol Biol，2003;19(3)：354-8.

3 李 鈳，李 伶，楊剛毅.成千維細胞生長因子21調控小鼠肝臟和脂肪細胞的糖脂代謝〔J〕.中華內分泌代謝雜志，2010;26(8)：699-702.

4 Yin JQ，Wan Y.RNA-mediated gene regulation system：now and the future〔J〕.Int J Mol Med，2002;10(4)：355-65.

5 Zamore PD.Ancient pathways programmed by small RNAs〔J〕.Science，2002;296(5571)：1265-9.

6 Semizarov D，Frost L，Sarthy A，et al.Specificity of short interfering RNA determined through gene expression signatures〔J〕.Proc Nutl Acad Sci USA，2003;100(11)：6347-52.

7 Jackson AL，Bartz SR，Schelter J，et al.Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNA〔iJ〕.Nat Biotechnol，2003;21(6)：635-7.

8 Sun XG，Song G，Liu JH，et al.Construction of plasmid vector with Tat and its ability to transducer fusion protein into cells〔J〕.Chin J Biochem Mol Biol，2003;19(3)：354-8.

Construction and identification of FGF-21 siRNA recombinant adenovirus vector

YANG Xiao-Min，YANG Gang-Yi，LI Ling，et al.
Department of Endocrinology，the Second Affiliated Hospital，Chongqing University of Medical Science，Chongqing 400016，China

Objective To construct the RNA interference adenovirus expression vector specific for fibroblast growth factor-21(FGF-21)gene.Methods Firstly，the plasmid pSilencer1.0-shFGF-21 developed a vector-based system in earlier studies was digested by BamHⅠ+HindⅢ for getting the fragment.The adenovirus vector plasmid，pAd-shFGF-21 was constructed according to a two-step transformation protocol.The newly constructed plasmid was transfected into 293 packaging cells to grow adenovirus，which was further multiplied and purified.Results The recombinant adenoviral plasmid pAd-shFGF-21 was successfully constructed.The titer of the purified pAd-shFGF-21 was 1×1010PFU/mL.Conclusions The RNA interference adenovirus expression vector specific for FGF-21 gene is established successfully.

RNA interference;Adenovirus vector;FGF-21;Adiponectin

R329.25;394.3

A

1005-9202(2012)23-5173-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.033

國家自然科學基金項目(30771037，30871199，30971388，81070640)

1 重慶醫科大學附屬第二醫院內分泌科

李 伶(1962-)，女，教授，博士生導師，主要從事糖尿病及其并發癥的基因診斷及治療研究。

楊小敏(1989-)，女，碩士，主要從事糖脂代謝紊亂與胰島抵抗研究。

〔2012-02-16收稿 2012-06-16修回〕

(編輯 曹夢園)