腺苷對大鼠缺血再灌注心肌IGF-1蛋白的影響

楊 柳，王 雄，張 慧，黃宏亮

急性心肌梗死已成為心血管事件中致死率很高的疾病，其主要治療方法是將閉塞的血管快速恢復(fù)血流供應(yīng)，減輕心肌組織損傷。然而，大量動物及臨床實(shí)驗(yàn)證明，缺血心肌再灌注可發(fā)生心律失常、梗死面積擴(kuò)大及心肌功能障礙。因此，在恢復(fù)缺血心肌血流供應(yīng)的同時(shí)能減輕缺血再灌注損傷已成為國內(nèi)外研究的主要課題。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察腺苷對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 雄性Wistar大鼠24只，體重250g±30g，山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室提供。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（iv組）、缺血再灌注模型組（I／R組）、缺血再灌注后腺苷處理組（AD組）。iv組只進(jìn)行手術(shù)不處理；I／R組缺血30min，再灌注2h；AD組缺血30min，再灌注2h，經(jīng)股靜脈緩慢注射腺苷［305μg／（kg·min）］，持續(xù)5min。腺苷（美國 Sigma公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）試劑盒均購自武漢博士德公司。HX-200動物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；RN6240B型多道生理信號聚集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）；BI-200醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 制備動物模型 取稱重后Wistar大鼠，應(yīng)用25%烏拉坦腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定手術(shù)臺上，經(jīng)氣管插管連接呼吸機(jī)，以針形電極置于四肢皮下記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于胸部左側(cè)第3～4肋骨處開口，并暴露縱膈及心臟，于左心耳下2mm處穿6-0絲線，結(jié)扎左冠狀動脈前降支（iv組只穿線不結(jié)扎），觀察肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段抬高大于0.2mV，結(jié)扎30 min后松開血管，可見ST段回落，再灌注2h（AD組經(jīng)股靜脈注射腺苷5min）將大鼠處死，取出心臟浸泡于10%甲醛溶液中。

1.3 標(biāo)本檢測

1.3.1 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡 取梗死心肌組織，固定后石蠟包埋、切片，按照試劑盒提供方法操作，DAB顯色，光鏡下觀察凋亡細(xì)胞核呈棕黃色（TUNEL陽性），每張切片在400高倍鏡下隨機(jī)選取10個非重疊視野，計(jì)算凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)／心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.2 RT-PCR技術(shù)檢測miRNA-1 取100mg心肌組織，Trizol法提取總RNA，紫外吸收測定法檢測RNA純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Realtime PCR儀進(jìn)行PCR檢測，以U6作為內(nèi)參，miRNA-1的上游引物5′GGGGTGGAATGTAAAGAAG3′，下游引物5′TGCGTGTCGTGGAGTC3′。內(nèi)參U6的上游引物5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′， 下 游 引 物 5′ CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′，數(shù) 據(jù) 采 用2-△△Ct法 進(jìn) 行 計(jì)算。

1.3.3 免疫組化（SP）法測IGF-1 取左心室前壁組織經(jīng)10%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，嚴(yán)格按SP試劑盒說明書進(jìn)行SABC法染色，DAB顯色，切片封固。400高倍鏡下觀察以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為IGF-1蛋白表達(dá)陽性。采用BI-200圖像分析系統(tǒng)測量平均光密度值，其光密度大小與IGF-1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組資料之間比較用方差分析，兩組之間比較用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞凋亡檢測 I／R組凋亡心肌細(xì)胞明顯增加，呈彌漫分布，AD組凋亡細(xì)胞較少，iv組偶見凋亡的心肌細(xì)胞。I／R組有較高的心肌細(xì)胞凋亡率，較iv組明顯增高（P＜0.05）。與I／R組比較，AD組心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 IGF-1蛋白表達(dá)比較 與iv組相比，I／R組IGF-1蛋白表達(dá)率明顯增多（P＜0.05）；與I／R組相比，AD組IGF-1蛋白表達(dá)率增多（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組心肌組織IGF-1蛋白表達(dá)及凋亡指數(shù)（x±s）

2.3 心肌組織中miRNA-1的表達(dá)變化 與空白組相比，I／R組、AD組miRNA-1表達(dá)水平升高，升高后為原來的4.42倍和2.06倍。與I／R組相比，AD組miRNA-1表達(dá)水平降低，降低后為原來的2.15倍。

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是指缺血的心肌細(xì)胞經(jīng)恢復(fù)供血后產(chǎn)生更為嚴(yán)重的損傷。現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷有著非常密切的關(guān)系［1］。其作用機(jī)制極為復(fù)雜，主要包括生成大量氧自由基，再灌注細(xì)胞內(nèi)鈣超載，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，細(xì)胞凋亡及白細(xì)胞與血小板之間相互作用的關(guān)系等［2］。心肌持續(xù)性缺血導(dǎo)致組織損傷及細(xì)胞死亡，早期再灌注能夠有效減輕心肌缺血的損傷程度，但大量實(shí)驗(yàn)和臨床觀察，再灌注后改善心肌供血的同時(shí)又加重了單純心肌缺血造成的損傷，出現(xiàn)再灌注心律失常、梗死面積擴(kuò)大、心室收縮功能降低等情況。研究發(fā)現(xiàn)，腺苷可以通過多種途徑保護(hù)心肌缺血再灌注損傷，舒張冠狀動脈，加強(qiáng)心肌缺血預(yù)處理，減少心肌梗死范圍，減輕炎性反應(yīng)［3］等。腺苷使心肌的梗死面積明顯減少的同時(shí)增加了心肌缺血后的功能恢復(fù)，減輕了再灌注損傷，增強(qiáng)了心臟的保護(hù)作用［4］。腺苷通過作用于效應(yīng)器官上的腺苷受體完成生理功能，目前已知的受體亞型有四種，分別是A1、A2A、A2B、A3受體。其保護(hù)機(jī)制可能通過以下幾種方式：A1受體介導(dǎo)的抗親脂效應(yīng)穩(wěn)定細(xì)胞膜，減少細(xì)胞內(nèi)乳酸產(chǎn)量和酸中毒，阻止脂質(zhì)過氧化；腺苷激活A(yù)1受體開放心肌鉀通道，引起心肌細(xì)胞超極化，減少鈣離子通過電壓門控通道，同時(shí)，抑制腺苷酸環(huán)化酶的激活，減少慢鈣通道的磷酸化，減少鈣離子通過該通道。最終減少心肌細(xì)胞鈣超載，起到心肌保護(hù)作用。腺苷激活A(yù)2A受體抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子，減少中性粒細(xì)胞的附壁作用，并減輕由中性粒細(xì)胞聚集和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的縮血管物質(zhì)的釋放，減少活化的血小板；腺苷激活A(yù)2受體明顯抑制腫瘤壞死因子α，可能有助于腺苷對再灌注后心肌保護(hù)的作用。Zhao等［5］證實(shí)，在再灌注階段使用腺苷激活A(yù)2A受體抑制細(xì)胞凋亡。A2受體的激活使活性氧的產(chǎn)生下降，繼而減少活性氧簇誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，可能是抑制細(xì)胞凋亡的途徑。Masakatsu等［6］研究表明，心肌梗死后腺苷A2B受體長期興奮使非梗死區(qū)心肌的纖維化降低，改善了心肌重塑，改善心臟功能。腺苷保護(hù)心肌的途徑有很多，但通過影響IGF-1蛋白含量來減輕心肌缺血再灌注損傷未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，AD組較I／R組心肌組織中IGF-1蛋白含量明顯增加，細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，驗(yàn)證了腺苷通過增加IGF-1蛋白含量對心臟起保護(hù)作用。Shan等［7］研究顯示，miRNA-1轉(zhuǎn)錄后抑制IGF-1蛋白表達(dá)削弱了心肌細(xì)胞的抗凋亡作用。提示miRNA-1有促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的作用。在大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)，miRNA-1的水平會升高。在對比I／R組與AD組心肌組織中miRNA-1的表達(dá)及IGF-1蛋白含量變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)AD組較I／R組IGF-1蛋白含量增加的同時(shí)miRNA-1表達(dá)下調(diào)，這表示腺苷有可能通過抑制miRNA-1的表達(dá)機(jī)制使IGF-1蛋白含量增加，從而達(dá)到減少心肌缺血再灌注損傷的作用，但由于樣本量較小其作用機(jī)制尚待大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)有助于認(rèn)識miRNAS在心肌缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制，并為腺苷防治和減輕心肌缺血性損傷提供新的研究資料和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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