紅景天對阿爾茨海默病模型大鼠行為學及海馬區突觸相關蛋白的影響1）

孫宏燕，董聯玲，崔紅燕，曹 娟

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD），又稱老年性癡呆（Senile dementia），是一種病因未明的神經系統退行性疾病，表現為大腦皮層獲得性高級功能的全面障礙，包括記憶、語言、感覺和運動等功能的進行性受損，并常伴有人格、性格和情感控制等方面的異常。中藥紅景天為景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola L.）多年生草本或亞灌木植物，具有改善心腦血管系統功能、增強免疫、抗疲勞、耐缺氧、抗衰老等多方面藥理作用，研究表明紅景天有很廣闊的應用前景［1］。本實驗通過觀測紅景天對AD大鼠行為學及海馬組織突觸后致密蛋白（PSD-95）、shank-1蛋白表達的影響，進一步研究紅景天治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：5月齡健康雄性Wistar大鼠40只，體重（350±20）g，由山西醫科大學生理教研室提供。藥品及主要試劑：紅景天顆粒；喜得鎮；AlCl3；D-半乳糖；PSD-95、shank-1免疫組化試劑盒。主要儀器：MT-200Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統；電子天平；低溫冰箱；熒光照相顯微鏡；Olympus照相顯微鏡等。

1.2 試驗方法 模型制備：藥物造模組以腹腔注射D-半乳糖50mg／（kg·d）和灌胃 AlCl32mL／d，每日一次，持續6周。行為學測試前10min對藥物造模組以2mg／kg腹腔注射東莨菪堿制作AD大鼠復合模型［2］，空白組給予相同劑量的生理鹽水腹腔注射和灌胃。分組及給藥：動物適應性飼養1周后，40只雄性Wistar大鼠經水迷宮測試去掉不符合條件者。將39只大鼠按隨機數字表法分成空白對照組（9只）和藥物造模組（30只）。造模6周后進行水迷宮測試做出模型評價。模型評價標準：以空白組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，計算每只大鼠的平均逃避潛伏期值與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比值，該值＞20%則表示造模成功。將造模成功的大鼠（26只）分為模型組（8只）、中藥組（9只）和西藥組（9只）。第7周開始同時給藥干預：中藥組用紅景天按生藥5g／（kg·d）灌胃，西藥組用喜得鎮以1mg／（kg·d）灌胃，空白對照組以1 0 mL／（kg·d）蒸餾水灌胃，持續4周。水迷宮行為學測試：參照Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）實驗方法測定大鼠空間識別能力（包括定位航行實驗和空間搜索實驗）［3］。

1.3 標本制備及指標檢測 水迷宮測試24h后，采取心臟灌注法處死大鼠，用10%中性緩沖液甲醛固定4h以上，石蠟包埋切片。采用免疫組化法根據說明書檢測PSD-95、shank1蛋白含量。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0統計學軟件，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，各組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 水迷宮測試結果

2.1.1 定位航行試驗（見表1） 隨著訓練時間的推移，訓練次數的增多，各組大鼠尋找平臺的時間縮短。模型組大鼠潛伏期較空白組明顯延長（P＜0.01），中藥組、西藥組大鼠潛伏期較模型組明顯縮短（P＜0.01），而中藥組與西藥組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠在定位航行實驗中的平均逃避潛伏期（x±s）s

2.1.2 空間搜索實驗結果比較（見表2） 與模型組相比，其他各組目的象限停留時間、有效區停留時間、平臺停留時間明顯延長（P＜0．01），中藥組與西藥組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠空間搜索實驗結果比較（x±s） s

2.2 各組大鼠海馬區免疫組化結果比較（見表3） 與空白組相比，模型組大鼠PSD-9 5、shank-1蛋白表達均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，中藥組與西藥組PSD-95、shank-1蛋白表達顯著提高（P＜0.01），中藥組、西藥組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠PSD-95、shank-1免疫組化比較（x±s）

3 討 論

本研究采用復合型AD大鼠模型，集衰老、鋁中毒、膽堿能損傷為一體，可以更好地模擬出AD患者的病理生理及行為學表現。紅景天具有益氣活血、通脈平喘等功效，《本草綱目》記載“紅景天，本經上品，祛邪惡氣，補諸不足”是“已知補益藥中所罕見”，臨床及實驗研究初步研究表明，紅景天具有抗缺氧、抗疲勞、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等作用，顯示出紅景天對癡呆治療有廣闊的應用前景。本研究采用Morris水迷宮方法檢測AD大鼠行為學能力變化，結果顯示，模型組認知能力較空白組明顯下降，經治療后，中藥組、西藥組與模型組相比認知能力明顯改善，表明紅景天在一定程度上改善了AD大鼠的學習記憶功能障礙。

學習和記憶障礙為AD早期的突出表現，其程度與突觸數目的丟失及突觸功能的喪失密切相關［4］。神經元的動態特征即突觸可塑性，是學習記憶形成的一個重要形態學和功能學基礎，其主要表現形式是長時程增強和長時程抑制。突觸后致密物質（postsynaptic density，PSD）是化學性突觸的一種超微結構，接受和整合突觸信號并將其傳導給突觸后細胞，在突觸可塑性中起重要作用。其中PSD-95是細胞支架蛋白，能影響突觸及神經元的可塑性，神經遞質以及其他神經營養因子的合成，調控神經元對神經傳導信號的免疫應答，在突觸發育和再塑中具有重要的作用。目前研究表明，PSD-95參與了學習記憶的調節過程，對學習記憶的形成和鞏固有著重要意義［5］。shank是一種表達在PSD區域的多結構域的骨架蛋白，在突觸信號轉導中起重要作用。多項研究表明，shank-1可將突觸后膜上的3種谷氨酸受體串聯起來，結合于NMDA信號復合體中調節長時程增強和長時程抑制。此外，shank-1蛋白連接了突觸后的谷氨酸、磷酸肌醇、生長抑素等多型受體、多種蛋白和細胞骨架。因此，在介導各種受體間的信號傳導和維持突觸正常功能方面有重要作用［6，7］。本研究結果提示，模型組PSD-95和shank-1蛋白的表達明顯下降，經治療后中、西藥組PSD-95和shank-1蛋白表達明顯上調，表明紅景天可以增加PSD-95和shank-1蛋白表達。中、西藥組之間比較差別無統計學意義，表明紅景天治療AD與喜得鎮等效。

紅景天對AD大鼠腦神經細胞的保護作用可能是通過上調PSD-95和shank-1蛋白的表達，從而影響突觸及神經元的可塑性、神經遞質以及其他神經營養因子的合成、調控神經元對神經傳導信號的免疫應答，進而改善AD大鼠的學習記憶能力，對AD的防治具有現實意義，但具體機制有待于進一步研究。

［1］ 王家明，閏繼平，王盛虔.紅景天的藥理作用進展［J］.中醫藥學報，2003，31（4）：57.

［2］ 宋玉娟，張力，徐會深，等.電針治療阿爾茨海默病的實驗研究［J］.中醫藥學報，2005，33（3），39-40.

［3］ 胡鏡清，溫澤淮，賴世隆，等.Morris水迷宮檢測的記憶屬性與方法學初探［J］.廣州中醫藥大學學報，2000，17（2）：117-120.

［4］ Coleman PD，Yao PJ.Synaptic slaughter in Alzheimer’s disease［J］.Neurobiol Aging，2003，24（8）：1023-1027.

［5］ Liaw WJ，Zhang B，Tao F，et al.Knockdown of spinal cord postsynaptic density protein-95prevents the development of morphine tolerance in rats［J］.Neurosci，2004，123（1）：11-15.

［6］ Sheng M，Kim E.The Shank family of scaffold proteins［J］.Cell Sci，2000，113（pt11）：1851-1856.

［7］ Valt Schanoff JG，Weinberg RJ.Laminar organization of the NMDA receptor complex within the post-synaptic density［J］.Neuroscience，2001，21：1211-1217.