RNA干擾survivin基因對宮頸癌細胞中survivin蛋白表達及caspase-3酶活性的影響

李元宏 常冰梅

1.山西醫科大學，山西太原 030006；2.山西醫科大學汾陽學院，山西汾陽 032200

RNA干擾survivin基因對宮頸癌細胞中survivin蛋白表達及caspase-3酶活性的影響

李元宏1，2常冰梅1

1.山西醫科大學，山西太原 030006；2.山西醫科大學汾陽學院，山西汾陽 032200

目的 觀察RNA干擾survivin基因對宮頸癌細胞中survivin蛋白表達及caspase-3酶活性的影響。 方法 針對survivin mRNA序列設計合成3對編碼小干擾RNA（siRNA）的DNA模板，構建shRNA重組質粒，轉染Hela細胞，篩選獲得轉染效率最高的陽性克隆，陰性對照為陽性克隆隨機打亂序列。Western blot方法檢測survivin蛋白表達，分光光度法檢測caspase-3酶活性。 結果 干擾48 h時，siRNA-168載體干預組干預效果最好，siRNA陽性質粒干擾組（實驗組）survivin蛋白表達量為陰性對照組中survivin蛋白表達量的13%，是空白組survivin蛋白表達量的16%。干擾后caspase-3活性表達升高，實驗組與陰性對照組、實驗組與空白組相比差異均有統計學意義（P＜0.05）。 結論 siRNA可有效抑制Hela細胞survivin蛋白表達，升高caspase-3酶活性。

survivin基因；宮頸癌細胞；survivin蛋白；caspase-3

宮頸癌是女性近年來常見的惡性腫瘤之一，是由人類乳頭瘤病毒（HPV）引起，在全世界，發展中國家宮頸癌發病率較高，我國每年新增病例13萬以上[1]，每年有20多萬名女性死于該病。survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性，表達于腫瘤組織[2]。RNA干擾是與靶基因同源的雙鏈RNA誘導的特異轉錄后基因沉默現象，其作用機制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產生干擾小RNA（siRNA），這些siRNA與同源的靶RNA互補結合，特異性酶會降解靶RNA[3]，該技術已經發展成為基因治療、基因結構功能研究的常用技術。本研究擬采用RNA干擾技術[4]，針對人survivin基因mRNA序列構建3個siRNA重組質粒，轉染人宮頸癌Hela細胞，觀察其對細胞survivin蛋白表達的變化及細胞內caspase-3酶活性的變化，進而了解細胞凋亡變化，為宮頸癌的預防、檢測、治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質粒與細胞株 siRNA重組質粒及陰性對照由上海瑞賽生物技術公司構建，人宮頸癌Hela細胞由山西醫科大學生物化學與分子生物學實驗室提供。

1.1.2 試劑 脂質體LipofectamineTM2000（美國Gibco公司），DMEM培養基（美國Gibco公司），Opti-MEMRⅠ培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青），survivin及GAPDH一抗、二抗（愛博生公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 根據實驗目的分為實驗組、陰性對照組及空白組。實驗組采用構建陽性重組質粒轉染；陰性對照組采用隨機打亂的陽性質粒序列進行轉染；空白組無干擾。

1.2.2 細胞轉染 Hela細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基常規培養，每2～3天傳代1次。重組質粒的轉染在細胞對數生長期進行，調整細胞密度為 4×106～5×106/mL，轉染前 1 d，將細胞懸液接種至6孔板。以250 μL Opti-MEMⅠ稀釋5 μL LipofectamineTM2000，輕輕混勻，室溫下孵育 5 min。以 250 μL Opti-MEMⅠ稀釋7.5 μL siRNA，輕輕混勻，孵育5 min后，將稀釋的siRNA和稀釋的LipofectamineTM2000輕輕混合，在室溫下孵育20 min，以便允許復合物的形成。將siRNA-LipofectamineTM2000復合物加入到6孔板中，輕輕搖動混合，37℃，5%CO2培養箱孵育48 h，進行熒光檢測。分別取5個視野觀察干擾效果，取平均值，公式計算干擾率（%）=（陰性對照組-實驗組）/陰性對照組。

1.2.3 Western blot法檢測survivin蛋白表達量 6孔板中每孔加入1 mL總蛋白提取液，充分吹打，在冰上放置10～20 min后，再吹打5～20 min，將勻漿液吸出置于 1.5 mL離心管中，超聲 3 次，每次 3 s，9 000 r/min，離心 5 min，取適量上清置于新的1.5 mL離心管中。取上清液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將目的條帶電轉移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的TTBS封閉1 h。加入一抗，37℃孵育l h，加入二抗，室溫孵育45 min，化學發光法顯色。

1.2.4 caspase-3活性檢測 采用分光光度法利用caspase-3活性檢測試劑盒進行caspase-3活性檢測。首先制作pNA濃度/A405吸光度的標準曲線，繪制標準曲線方程式，然后在被檢測標本中加入底物Ac-DEVD-pNA 2 mmol/L后混勻，37℃孵育60～120 min，發現顏色變化比較明顯時即可測定A405。樣品的A405扣除空白對照的A405，即為樣品中caspase-3催化產生的pNA產生的吸光度。由標準曲線方程Y=98.6946X-23.9127（Y為pNA濃度，X為A405吸光度值）求出各樣本pNA濃度。Braford法測定樣本蛋白濃度，caspase-3活性=Y/蛋白濃度，計算出caspase-3酶活力大小。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，三組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 干擾效果觀察

光鏡下觀察干擾48 h效果可見，陽性質粒干擾后，成功干擾細胞數占細胞總數70%以上，可以進行后續試驗。見圖1。

2.2 三組survivin蛋白表達量比較

轉染48 h后，用灰度掃描軟件測量Western blot實驗結果顯示：實驗組survivin蛋白表達量為陰性對照組survivin蛋白表達量的13%，是空白組survivin蛋白表達量的16%。見圖 2、3。

2.3 三組caspase-3活性檢測情況

各組酶活力單位檢測結果顯示，空白組為（1.32±0.10），陰性對照組為（1.61±0.20），實驗組為（3.40±0.26），實驗組與陰性對照組、空白組相比差異均有統計學意義（P＜0.05），即siRNA干擾組顯著升高了caspase-3酶活性。

3 討論

survivin基因是一個抗凋亡基因，因為其抑制凋亡有利于腫瘤細胞存活而得名為“存活素”，其組織學分布具有特異性，且具有強大的抗細胞凋亡能力和特殊的作用途徑及位點[5]。研究表明，survivin基因決定簇缺失的突變體能誘導細胞自發性凋亡，從而抑制腫瘤的生長進，使其逐漸成為腫瘤病因及治療研究熱點。RNAi是一種轉錄后的基因緘默，它能觸發某種轉錄后監控程序，導致特定mRNA單鏈的降解。survivin蛋白在參與細胞凋亡過程中有兩條途徑：外源性凋亡途徑和內源性凋亡途徑。外源性凋亡途徑又稱為死亡受體通路，是由胞外腫瘤壞死因子（TNF）超家族的死亡配體引發。內源性凋亡途徑又稱為線粒體/細胞色素C介導的通路[6]。實驗表明，細胞色素C從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟，釋放出的的細胞色素C在dATP存在下能與凋亡相關因子1（Apaf-1）結合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9進一步激活其他的caspase，如caspase-3等，從而誘導細胞凋亡[7]。survivin蛋白還可直接作用于caspase，主要抑制caspase-3和caspase-7的活性，同時，survivin也可通過P21間接抑制caspase。目前凋亡過程的詳細機制還不完全清楚[8]，但是caspase在凋亡過程中發揮重要的作用，細胞凋亡的過程實際上是caspase不可逆的水解底物的級聯放大反應過程，到目前為止，已發現至少14種caspase。caspase活化有兩種機制，即同源活化和異源活化。被異源活化的caspase又稱為執行caspase，包括 caspase-3、caspase-6 和 caspase-7。

筆者應用RNAi技術將survivin siRNA轉染survivin高表達的宮頸癌Hela細胞株，使survivin基因表達下調，結果顯示，Hela細胞的生長速度減慢，survivin蛋白表達也相應下降，caspase-3的酶活性增加，細胞凋亡率增加。這表明survivin siRNA能夠成功下調細胞內survivin基因的表達，有效降低survivin對caspase的抑制作用，進而引發一系列細胞和分子生物學的改變，促進細胞凋亡，抑制細胞生長。這些現象提示我們survivin過度表達與宮頸癌的發生、發展密切相關，是該病治療的重要靶標，為宮頸癌的治療研究提供重要的依據。

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The effects of RNA interference survivin gene on the expression of survivin protein and caspase-3 enzyme activity in cervical cancer cells

LI Yuanhong1，2CHANG Bingmei1

1.Shanxi Medical University,Shanxi Province,Taiyuan 030006,China;2.Fenyang College Shanxi Medical University,Shanxi Province,Fenyang 032200,China

ObjectiveTo investigate the effect of RNA survivin interference gene on the expression of survivin protein and the activity of caspase-3 enzyme in cervical cancer cells.MethodsAccording to the survivin mRNA sequence,3 pairs of DNA template for small interference RNA(siRNA)was designed and synthetized,shRNA recombination plasmid was built,Hela cells was transfected.The positive clones with the highest transfection efficiency was isolated,and negative control was the randomly upseted sequence of positive clones.Western blot method was used to detect the expression of survivin protein and spectrophotometry was used to detect the activity of caspase-3 enzyme.ResultsAt 48 h of interference,the siRNA-168 vectors intervention group had the best effect.The survivin protein expression of the siRNA positive plasmid interfern group(experimental group)was 13%of the negative control group,which was 16%of the blank control group.After interference,the activity of caspase-3 rised and there was significant difference not only between experimental group and negative control group,but also between experimental group and blank control control(P＜0.05).ConclusionsiRNA can inhibit the expression of survivin protein in Hela cells effectively and increase caspase-3 activity.

Survivin gene;Cervical cancer cell;Survivin protein;Caspase-3

R737.3

A

1673-7210（2012）08（a）-0022-03

李元宏（1974.9-），男，碩士研究生，山西醫科大學汾陽學院講師；研究方向：腫瘤分子生物學。

常冰梅，女，博士研究生，山西醫科大學副教授。

2012-03-01 本文編輯：程 銘）