鴨髓樣分化因子MyD88部分cDNA克隆及組織表達圖譜分析

郭智莉，周作勇，聶 奎

（1.西南大學動物科技學院，重慶 北碚400715；2.西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌402460）

髓樣分化因子MyD88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）最初被認為是一種髓樣分化標記蛋白。1990年，Load發現了髓樣分化基因家族成員中的新基因MyD88［1］。MyD88是Toll樣受體（Toll－like receptors，TLRs）信號轉導通路中關鍵的轉接分子，具有使核轉錄因子κB（nuclear factor κB，NF－κB）活化轉位進核，表達一系列特定的基因和致炎因子，如 TNF－α、IL－1和IL－18等。MyD88基因編碼蛋白具有3個功能區域：N端的死亡結構域、中間區域及c端的TIR結構域。有文獻表明，MyD88作為胞內能夠介導10個TLRs家族的信號傳導［2］。在人和鼠TLRs研究中發現，MyD88激活NF－κB途徑介導了系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病的發生［3］，還導致心肌肥大［4］、參與了呼吸道炎癥反應［5］和動脈粥樣硬化斑塊形成［6］等。

迄今為止，多個哺乳動物、魚類、鳥類和無脊椎動物的MyD88分子已被鑒別，但是有關鴨的MyD88分子卻未見報道。本試驗以櫻桃谷鴨為試驗對象，對鴨MyD88部分cDNA進行克隆及生物信息學分析，并對MyD88mRNA在鴨不同組織中的轉錄情況進行檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 10日齡櫻桃谷鴨，購自重慶榮昌某鴨廠。

1.2 主要試劑 大腸埃希菌DH5α為本實驗室保存；RNAisoTMPlus、Taq酶、pMD 19－T、X－gal、RTPCR試劑盒、Amp，購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒，購自OMEGA公司。

1.3 引物設計與合成 參照GenBank中已發表的雞（NM＿001030962）、人（NM＿001172568）、家鼠（NM＿198130）的 MyD88CDS序列，用DNAStar軟件進行相似比對，在保守序列中用Primer5.0設計cDNA 引物，MyD88：F0 5′－GTTGGAGCAAACGGAGTTCA－3′，R0 5′－CCTGGGGAAAGACTAAGAGCA－3′，擴增片段為195bp；參照鴨（AY43－6595）GAPDH 基因序列設計引物，GAPDH：F1 5′－GCCCAGAACATTATCCCA－3′， R1 5′－AGGTCAGGTCCACGAACA－3′，擴增片段為152bp；由Invitrogen（上海）公司合成引物。

1.4 總RNA的提取 采鴨心臟、肝臟、脾臟等7種組織各0.1g。參照TaKaRa公司的RNAisoTMPlus試劑說明書提取各組織的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA完整性。－70℃保存備用。

1.5 RT－PCR擴增 以鴨組織總RNA為模板，按RT－PCR的方法擴增目的片段。cDNA反轉錄體系（10μL）：5×Prime ScriptTMBuffer 2μL，Prime ScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5μL，Oligo dT Primer（50μmol／L）0.5μL，Random 6mers（100μmol／L）0.5μL，Total RNA 3μL，RNase Free dH2O 3.5μL，37℃15min，85℃5s。PCR體系（25μL）：cDNA 2μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 0.5μL，Mg2＋1μL，引物F和 R各加入0.5μL，rTaq酶0.25μL，滅菌dH2O至25μL；擴增參數為：94℃預變性5min；94℃30s，60℃30s，72℃30 s，30個循環；72℃延伸5min。

1.6 目標基因的克隆及測序 將50μL RT－PCR產物經電泳后，按膠回收試劑盒回收目的片段。連接體系（10μL）：4.2μL回收產物，0.8μL pMD 19－T，5μL SolutionⅠ，混勻4℃連接過夜；轉化入100 μL DH5α感受態細胞，冰浴30min，42℃熱沖擊90 s，冰浴2min，加入890μL LB液體培養基，37℃振蕩培養1.5h后將菌液涂于含IPTG＋X－gal＋Amp的LB固體培養基上，37℃過夜培養；挑選陽性單菌落接種于含Amp的LB液體培養基，37℃振蕩過夜，菌液PCR鑒定后，送陽性克隆至Invitrogen（上海）公司測序。

1.7 序列分析 將測序所得部分cDNA序列在GenBank數據庫中進行BLAST初步比較分析，利用DNAStar軟件推測目的片段所編碼的氨基酸序列，并用Clustal W方法比對目的氨基酸片段與其他物種MyD88氨基酸片段的同源性，建立系統進化樹。

2 結果

2.1 鴨MyD88RT－PCR檢測結果 以鴨脾臟cDNA為模板，采用RT－PCR方法擴增MyD88目的片段，經3%瓊脂糖凝膠電泳后出現1條特異性條帶，長度為195bp（圖1）。將純化的目的片段克隆到載體，重組質粒經菌液PCR鑒定，得到預期大小目的片段，命名為pMyD88。

圖1 MyD88部分基因RT－PCR產物電泳結果

2.2 MyD88測序及分析 陽性質粒測序后得到195bp的pMyD88基因序列：

GTTGGAGCAAACGGAGTTCAAGCTGAAGCTCT GTGTCTTTGACCGGGACGTCTTGCCAGGAACG TGCGTGTGGTCCATCAGCGGAGAGCTTATAGA AAGGAGGTGTCGGAGGATGGTGGTCGTCATTT CAGACGATTACCTGGAAAGCGACGAATGCGAC TTTCAGACCAAATTTGCTCTTAGTCTTTCCCCA GG

在GenBank數據庫進行BLAST初步比較分析發現，pMyD88基因序列與G.gallus（NM＿001030962.1）、M.gallopavo（XM＿003206927.1）、T.guttata（XM＿002196725.1）、R.norvegicus（NM＿198130.1）、H.sapiens（NM＿001172568.1）的相似性分別為92%、92%、89%、78%、76%。

2.3 MyD88氨基酸同源性及系統進化樹分析 由pMyD88基因序列推導的氨基酸序列經BLAST分析，該cDNA部分基因位于編碼MyD88分子TIR結構域內，與GenBank登錄的其他物種相應MyD88TIR域氨基酸序列作同源性比對結果表明（圖2），鴨 MyD88與雞、火雞、珍珠鳥的同源性最高，為97%～100%；與人、鼠、牛、豬、狗、馬、兔、鯉魚的同源性為83%～84%；與綿羊的同源性為 79%。

圖2 pMyD88推導氨基酸序列與其他物種間的同源性比較

DNAStar軟件進行系統進化樹分析（圖3），結果表明：鴨 MyD88與雞的親緣關系最接近，與火雞、珍珠鳥的較為接近，與狗、鼠、兔、人、豬、馬、綿羊、牛的親緣關系依次漸遠，與鯉魚的親緣關系最遠；其中鴨與雞、火雞在分化年限上最接近，說明他們的MyD88有密切關系。

圖3 pMyD88推導氨基酸序列與其他物種間的系統進化樹

2.4 MyD88在鴨組織中分布 RT－PCR結果顯示，以持家基因GAPDH為參照，MyD88基因在鴨心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腔上囊中均有表達，且表達量存在差異，在腎臟、腦中未見轉錄產物（圖4）。

圖4 鴨MyD88mRNA在組織中的轉錄情況

3 討論

MyD88屬于Toll／IL－lR家族和死亡結構域家族成員，MyD88的TIR結構域與TLRs和IL－1Rs的TIR相結合從而介導下游信號傳導，最終誘導炎癥細胞因子如IL－1、IL－6、IL－8、IL－12、TNF－α、干擾素和粘附因子等基因的表達，而通過抑制MyD88來減少細胞因子的表達能抑制疾病的發展［7］。MyD88分子在進化過程中具有較高的保守性，在各物種間TIR結果域的同源性明顯高于死亡結構域。李強等［8］克隆出豬MyD88完整的CDS序列，與人、牛、小鼠和褐鼠的MyD88分子對比后同源性在78.2%～88.4% 之間。Yafeng Qiu等［9］得出雞MyD88氨基酸序列與人、鼠MyD88同源性在70%左右。現還未見有關于鴨MyD88的研究，本試驗克隆出鴨MyD88部分cDNA序列，氨基酸序列比對結果表明，鴨MyD88TIR結構域與禽鳥類同源性較高，在進化中有較高的保守性。

早期的研究認為，MyD88僅在骨髓組織中表達［1］，但后來研究證明，MyD88可在哺乳動物的非骨髓組織中表達，且不同組織表達水平存在一定的差異，而且與動物年齡也有一定的關系［10］。以熱滅活嗜水氣單胞菌刺激中華鱉后48h內，肝、脾和腎組織中MyD88mRNA相對表達量均出現不同程度的增加［11］。本試驗檢測到鴨的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腔上囊均有MyD88mRNA轉錄，在腎臟、腦中未檢測到，且不同組織中MyD88的表達豐度存在差異，表明MyD88分布于鴨的周圍免疫器官、消化器官、呼吸器官、循環器官。提示MyD88在不同種屬動物及不同組織部位具有生物多樣性。

［1］Lord K A，Hoffman－Liebermann B，Liebermann D A.Nucleotide sequence and expression of a cDNA encoding MyD88，a novel myeloid differentiation primary response gene induced by IL－6［J］.Oncogene，1990，5（7）：1095－1097.

［2］Feng Y，Zhao H，Xu X，etal.Innate immune adaptor MyD88 mediates neutrophil reeruitment and myoeardial injury after isehemia－reperfusion in mice［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，295：H1311－H1318.

［3］趙永剛，周艷春，李明才，等.TLR／MyD88信號通路與自身免疫性疾病［J］.生命的化學，2008，28（4）：457－460.

［4］李躍華，哈團柱，陳琪，等.MyD88依賴性核因子－κB信號途徑在心肌肥大發生過程中的調控作用［J］.中華醫學雜志，2005，85（4）：267－272.

［5］馮艷，王芳，陳襄文，等.MyD88缺去突變基因轉染降低病原茵感染的人呼吸道上皮細胞IL－8的分泌［J］.生物醫學工程學雜志，2006，23（5）：1092－1095.

［6］Bj?rkbacka H，Kunjathoor V V，Moore K J，etal.Reduced atherosclerosis in MyD88－null mice links elevated serum cholesterol levels to activation of innate immunity signaling pathways［J］.Nat Med，2004，10（4）：416－421.

［7］唐光亮，范慧敏，劉中民.慢病毒介導siRNA干擾MyD88表達對大鼠肺泡巨噬細胞功能的影響［J］.同濟大學學報：醫學版，2010，31（3）：9－14.

［8］李強，李學偉，朱礪，等.豬 MyD88基因的克隆及組織表達譜分析［J］.畜牧獸醫學報，2009，40（10）：1429－1434.

［9］Yafeng Qiu，Yang Shen，Xiangdong Li，etal.Molecular cloning and functional characterization of a novel isoform of chicken myeloid differentiation factor 88（MyD88）［J］.Developmental and Comparative Immunology，2008（32）：1522－1530.

［10］Tohno M，Shimazu T，Aso H，etal.Molecular Cloning and Functional Characterization of Porcine MyD88Essential for TLR Signaling［J］.Cell Mol Immunol，2007，4（5）：369－376.

［11］朱炳林，李俊，方維煥，等.中華鱉MyD88部分序列克隆及其在組織中的表達差異分析［J］.水產學報，2010，34（7）：1018－1023.