外源咖啡酸和阿魏酸對黑莓汁中花色苷的輔色研究

彭常安，盧鋒波，袁 曄，唐小媛，韓永斌*

1蕪湖職業技術學院生物工程系，蕪湖241006; 2南京農業大學農業部農畜產品加工與質量控制重點開放試驗室，南京210095

外源咖啡酸和阿魏酸對黑莓汁中花色苷的輔色研究

彭常安1，盧鋒波2，袁 曄2，唐小媛2，韓永斌2*

1蕪湖職業技術學院生物工程系，蕪湖241006;2南京農業大學農業部農畜產品加工與質量控制重點開放試驗室，南京210095

為增強黑莓汁中花色苷的穩定，添加適量咖啡酸和阿魏酸到黑莓清汁中，采用可見吸收光譜和高效液相色譜-質譜研究其對黑莓花色苷的輔色作用。研究結果表明:黑莓汁中添加咖啡酸和阿魏酸顯著增加了花色苷的最大吸收值(Aλmax)，最大吸收波長(λmax)紅移，說明咖啡酸和阿魏酸對黑莓汁中花色苷產生了輔色作用，輔色效應隨時間的延長和咖啡酸、阿魏酸濃度的增加顯著增強。HPLC-DAD-MS分析發現，咖啡酸輔色產生了兩種新的花色苷衍生物(矢車菊素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基兒茶酚和矢車菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷-4-乙烯基兒茶酚)，阿魏酸輔色產生了三種新的花色苷衍生物(矢車菊素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基愈創木酚、矢車菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷-4-乙烯基愈創木酚和矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷-4-乙烯基愈創木酚)，這些衍生物均為羥苯基-吡喃花色苷。

黑莓汁;花色苷;咖啡酸;阿魏酸;輔色

輔色作用作為改善富含花色苷食品顏色穩定性的有效手段［1，2］，近年來已成為研究熱點。阿魏酸、香豆酸、芥子酸等酚酸類成分是重要的輔色素，在富含花色苷的植物中，通過酯鍵與花色苷酰基化后存在于液泡中［3-5］。在紅葡萄酒陳釀過程中這些酚酸成分與花色苷反應形成乙烯基吡喃花色苷，而非酰化花色苷，有效防止了水分子對花色苷母核的親核攻擊，從而提高花色苷的穩定性［6］;Gris等［7］的研究表明赤霞珠葡萄提取物中花色苷的穩定性受溫度、光線和pH值等的影響，但咖啡酸輔色可使其穩定性增加。

黑莓(Rubus spp.)為薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus L.)植物，花色苷含量較高，主要有矢車菊-3-O-葡萄糖苷、矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊-3-O-丙二酸酰葡萄糖苷和矢車菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷等，其中矢車菊-3-O-葡萄糖苷含量高達70%以上［8，9］。雖然黑莓中酚酸類含量較豐富［10，11］，但黑莓及其加工品的色澤卻很不穩定，在加工和貯藏過程中極易變色。本文首次研究了添加咖啡酸和阿魏酸對黑莓汁中花色苷的輔色作用，并采用HPLCDAD-MS鑒定了輔色所產生的花色苷衍生物。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

黑莓(Rubus spp.)凍果:江蘇新得利食品有限公司;咖啡酸和阿魏酸(色譜純):Sigma公司;其他試劑均為分析純。

TDL-40B離心機(上海安亭科學儀器廠);UV-2803紫外可見分分光光度計(美國尤尼克公司); pH計(Thermo Orion 868，Orion，USA);Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent，USA)。

1.2 黑莓清汁的制備

黑莓凍果經4℃隔夜解凍，榨汁機中打漿，2810 ×g離心15 min，上清液再經14800×g離心15 min得到澄清黑莓汁，于–16℃凍藏備用。

1.3 咖啡酸和阿魏酸的輔色

用無水乙醇配制濃度為10 mg/mL的咖啡酸和阿魏酸溶液，分別吸取100 μL和200 μL上述輔色劑溶液、2 mL黑莓汁，用pH 3.2的檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液定容至10 mL，得到最大吸收值(Aλmax)為0.9、酒精度在1～2°、咖啡酸和阿魏酸濃度為100或200 mg/L的黑莓汁。將該溶液于85℃滅菌15 min后，迅速冰水冷卻，于4℃避光放置30天，16℃放置30天后4℃放置。

1.4 花色苷及其衍生物HPLC-DAD-MS分析

采用Agilent SB-C18(4.6×250 mm，5 μm)柱進行HPLC分析，溫度35℃，流速為0.6 mL/min，200～600 nm全掃描。洗脫液為乙腈(B)和0.5%甲酸(A)(v:v)，洗脫梯度為0～10 min，10%～25%B; 10～25 min，25% ～30%B。電噴霧質譜毛細管溫度195℃電壓4 kV，分別以正負離子兩種模式，霧化壓力為2.33×105Pa，氮氣流速分別為6和1.2 mL/min。

1.5 統計與分析

采實驗設3次重復，結果取平均值，用SAS 9.1.3軟件進行多重比較分析(顯著性水平為0.05)。

2 結果與討論

2.1 咖啡酸與花色苷的輔色

2.1.1 可見吸收光譜的變化

輔色劑對花色苷的輔色效應通常表現為對花色苷的可見吸收光譜圖的影響，即最大吸收波長的移動(△λmax)和顏色增強效應-最大吸收值的增加(△Aλmax)［12］。由圖1可知，在黑莓汁體系下，咖啡酸的添加對花色苷的可見吸收光譜產生了顯著影響。與對照組相比，60 d時，添加咖啡酸100 mg/L、200 mg/L的花色苷溶液λmax分別右移了3 nm和5 nm，Aλmax分別增加了10.81%和58.38%;這表明咖啡酸與花色苷發生了分子間輔色作用，輔色效應隨咖啡酸濃度的增加顯著增強(P＜0.05);100 d后，咖啡酸處理組的Aλmax分別增加了33.34% 和 94.53%，輔色組間Aλmax差異顯著(P＜0.05)。可見，在黑莓汁體系下，咖啡酸的輔色作用隨咖啡酸濃度的增加而增強。

2.1.2 花色苷組成的變化

由圖2可知，咖啡酸輔色后對花色苷組成產生了影響。100 d時，輔色組中檢測到了大量的兩種花色苷衍生物:峰1'和峰2'。

2.2 阿魏酸與花色苷的輔色

2.2.1 可見吸收光譜的變化

由圖3可知，在黑莓汁體系下，阿魏酸的添加對花色苷的可見吸收光譜產生了顯著影響。與對照組相比，60 d時，咖啡酸處理組λmax分別右移5 nm和6 nm、Aλmax分別增加了32.43%和45.95%，表明阿魏酸與花色苷發生了較強的分子間輔色作用，輔色作用隨阿魏酸濃度的增加而增強(P＜0.05);輔色100 d后，輔色組Aλmax分別增加了72.75%和106.52%，輔色組間差異顯著(P＜0.05)。可見，在黑莓汁體系下，阿魏酸與花色苷的輔色反應較為緩慢，在60 d時輔色已明顯發生，60～100 d時，輔色反應仍在繼續，輔色強度隨阿魏酸濃度的增加而增強。

2.2.2 花色苷組成的變化

阿魏酸輔色后花色苷組成發生了變化(圖4)，100 d時，輔色組中檢測到了大量的三種花色苷衍生物:峰1''、峰2''和峰3''。

2.3 花色苷衍生物結構解析

據王衛東等報道［13］，黑莓花色苷各組分分別為矢車菊-3-O-葡萄糖苷(［M］+為m/z 449)、矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷(［M］+為m/z 419)、矢車菊-3-O-丙二酸酰葡萄糖苷(［M］+為m/z 535)和矢車菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷(［M］+為 m/z 593)。采用HPLC-PDA-MS技術對輔色后花色苷衍生物進行分析，經咖啡酸輔色后的花色苷衍生物主要有兩種，其分子量如表1所示，峰1'(［M］+為m/z 581)和峰2' (［M］+為m/z 725)分子量符合:MWC(咖啡酸輔色的花色苷衍生物分子量)=MWA(某花色苷分子量) +MWB(咖啡酸分子量180)-(44+1×4);同時，Rentzscha等［6］研究認為酚酸(阿魏酸、咖啡酸等)可在花色苷的C-4和C-5位發生加成反應形成吡喃型花色苷。據此可推測峰1'和峰2'分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷與咖啡酸在C-4和C-5位發生加成反應后形成的花色苷衍生物(圖5)。

表1 咖啡酸或阿魏酸輔色后的黑莓花色苷衍生物Table 1 Backberry anthocyanins derivatives co-pigmented with caffeic acid or ferulic acid

經阿魏酸輔色后的花色苷衍生物主要有三種，其分子量如表1所示，峰1''(［M］+為m/z 595)、峰2''(［M］+為m/z 739)和峰3''(［M］+為m/z 565)，分子量符合:MWC(阿魏酸輔色的花色苷衍生物分子量)=MWA(某花色苷分子量)+MWB(阿魏酸分子量194)-(44+1×4)。據此可推測峰1''、峰2''和峰3''分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷和矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷和阿魏酸在C-4和C-5位發生加成反應后形成的花色苷衍生物(圖5)。

圖5 咖啡酸或阿魏酸輔色形成的花色苷衍生物結構式Fig.5 Structures of blackberry anthocyanin derivatives co-pigmented with caffeic acid or ferulic acid

綜上，黑莓汁中咖啡酸和阿魏酸對花色苷產生了輔色作用，顯著增加了花色苷的最大吸收值;咖啡酸輔色和阿魏酸輔色分別產生了兩種和三種花色苷衍生物;其中，咖啡酸輔色產生的花色苷衍生物為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基兒茶酚加成物和矢車菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷-4-乙烯基兒茶酚加成物;阿魏酸產生的花色苷衍生物為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基愈創木酚加成物、矢車菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷-4-乙烯基愈創木酚加成物和矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷-4-乙烯基愈創木酚加成物。黑莓汁中花色苷易發生降解，導致黑莓汁顏色變為暗紅。以上試驗結果表明，添加適量咖啡酸和阿魏酸的能提高花色苷的穩定性，從而較大程度地保持黑莓汁的顏色和營養成分。

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Copigmentation Effects of Exogenous Caffeic Acid and Ferulic Acid on Anthocyanins in Blackberry Juice

PENG Chang-an1，LU Feng-bo2，YUAN Ye2，TANG Xiao-yuan2，HAN Yong-bin2*1Bioengineering Department Wuhu Vocational＆Technical College，Wuhu 241006，China;2Key Laboratory of Food Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China

To enhance the stability of anthocyanins in blackberry juice，the co-pigmentation effects of exogenous caffeic acid and ferulic acid on anthocyanins in blackberry juice were investigated using visible absorption spectra and HPLCDAD-MS.The results showed that both caffeic acid and ferulic acid could significantly increase the absorption intensity (Aλmax)and its wavelength(λmax)of anthocyanins in blackberry juice.These phenomena suggested occurrence of copigmentation effects of caffeic acid and ferulic acid on anthocyanins in blackberry juice.The co-pigmentation intensity depended on duration and concentrations of caffeic acid and ferulic acid.Two new anthocyanin derivatives(cyanidin-3-glucoside-4-vinylcatechol and cyanidin-3-dioxalylglucoside-4-vinylcatechol)and three new anthocyanin derivatives(cyanidin-3-glucoside-4-vinylguaiacol，cyanidin-3-dioxalylglucoside-4-vinylguaiacol and cyanidin-3-glucoside-arabinoside-4-vinylguaiacol)were observed in blackberry juice with HPLC-DAD-MS analysis by adding caffeic acid and ferulic acid，respectively.

blackberry juice;anthocyanin;caffeic acid;ferulic acid;co-pigmentation

1001-6880(2012)01-0094-04

2011-01-19 接受日期:2011-06-24

江蘇省自然基金項目(BK 2009649);國家科技服務企業項目(2009GJC10019);江蘇高校優勢學科建設工程資助項目

*通訊作者 Tel:86-25-84396293;E-mail:hanyongbin@njau.edu.cn

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