發酵液中多拉菌素的提取和萃取條件研究

鄒澤先，陳 新，張曉琳

1武漢工業學院，武漢430023;2國家糧食局科學研究院，北京100037

發酵液中多拉菌素的提取和萃取條件研究

鄒澤先1，2，陳 新1，張曉琳2*

1武漢工業學院，武漢430023;2國家糧食局科學研究院，北京100037

采用單因素實驗，分別研究提取試劑、發酵液放置時間、pH值和溫度對發酵液中多拉菌素提取效果的影響;然后以乙酸乙酯為萃取試劑，研究萃取次數及萃取體積對多拉菌素萃取效果的影響。結果顯示，甲醇為最佳提取試劑;發酵液在pH為3～11、溫度為20～80℃的條件下放置144 h，多拉菌素均能穩定存在，提取得到的多拉菌素的質量濃度沒有顯著變化;濃縮提取液液經2倍體積乙酸乙酯萃取2次即可。該條件下多拉菌素的質量濃度和萃取率分別為151.78 μg/mL和98.00%。

多拉菌素;發酵液;萃取條件

多拉菌素(doramectin)為20世紀90年代研制開發的新一代大環內酯類抗寄生蟲藥，是以環已烷羧酸(cyclohexanecarboxylic acid)為前體，通過基因重組的阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)新菌株發酵而成的一種阿維菌素類抗生素［1，2］。經近20年的研究，它被認為是目前阿維菌素族中最優秀的抗寄生蟲藥物之一，為內外兼殺劑，對線蟲、節肢動物均有良好的驅殺效果［3］，其在動物體內的代謝具有血藥濃度高、半衰期長、消除緩慢的特點［2］，是目前具有開發潛力的獸用抗寄生蟲藥物之一［4］。

多拉菌素的優良性能使得其在養殖業及寵物業上應用較為廣泛，但我國國內對于多拉菌素的研發則還只是處于初級階段［5］，目前多拉菌素的國內外文獻報道多集中在其藥代動力學研究和殘留檢測等方面［6］，包括以SPE固相萃取柱建立高通量的檢測方法［7］，以及以LC-MS快速分離并定量檢測微量殘留藥物的方法［8］，但有關多拉菌素提取及分離、純化方面則未見系統研究報道。本文旨在對多拉菌素發酵液的分離純化方面進行探索研究，為后續研究提供理論依據。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與常用儀器

1.1.1 菌種

菌種Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由國家糧食局科學研究院篩選保藏。

1.1.2 材料

多拉菌素發酵液(國家糧食局科學研究院提供);多拉菌素標準品購自Sigma，純度97.8%;甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇鹽酸及氫氧化鈉均為分析純，由北京化工廠生產;甲醇、乙腈為色譜純，Merck公司生產。

1.1.3 培養基

種子培養基:可溶性淀粉30 g/L，酵母提取物2 g/L，大豆蛋白2 g/L，CoCl2·6H2O 5 mg/L，pH 7.0～7.2，250 mL三角瓶裝樣量為50 mL。

發酵培養基:可溶性淀粉70 g/L，酵母膏16 g/ L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，KCl4g/L，CoCl2·6H2O 5 mg/L，pH 7.0～7.2，250 mL三角瓶裝樣量為50 mL。

培養基的滅菌條件是121℃滅菌30 min。

1.1.4 儀器

高效液相色譜儀(2487檢測器，515泵，717進樣器，美國waters公司);UV-2102 PC型紫外可見分光光度計(美國Unico公司);Eppendorf 5810R型離心機(德國Eppendorf公司);Delta型pH計(瑞士Mettler Toledo公司);SPY50雙層培養搖床(上海市離心機械研究所);SHB-III型水循環多用真空泵。

1.2 多拉菌素發酵提取液的濃縮提取液的制備

取1L多拉菌素發酵液，加入3倍的甲醇(V/ V)，震蕩搖勻，室溫下提取12 h，減壓抽濾得到上清液，減壓濃縮至原體積的1/3～1/4，即得到多拉菌素發酵液的濃縮提取液。

1.3 多拉菌素的標準曲線的繪制

準確稱取多拉菌素標準品0.0250 g，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線，配制成質量濃度為500 μg/mL的多拉菌素標準母液，然后再依次稀釋成質量濃度分別為300、200、100、50、20、10、5 μg/mL的多拉菌素標準溶液，將多拉菌素標準溶液在以下色譜條件下進樣檢測。色譜柱:Agilent Nucleosil 100—5 C18，3.5 μm，250 mm×4.0 mm;流動相:甲醇—乙腈水溶液(V甲醇∶V乙腈∶V水)= 45∶45∶10;流速:1.0 mL/min;進樣量10 μL;檢測波長:245 nm;柱溫:25℃。以多拉菌素標準溶液的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4 不同因素對多拉菌素發酵液提取效果的影響

1.4.1 不同的提取試劑

取5組50 mL的多拉菌素發酵液，加入3倍體積的不同有機溶劑:甲醇、乙醇、乙腈、丙酮及異丙醇，震蕩搖勻并于室溫提取12 h后，減壓抽濾得到上清液，再取上清液經0.22 μm的微孔濾膜過濾，HPLC分別測定各組溶液中多拉菌素的質量濃度，考察不同的提取試劑對多拉菌素提取效果的影響。各組設置3個重復。

1.4.2 發酵液pH

取7份50 mL的多拉菌素發酵液，分別用6 mol/L的NaOH或HCl調節pH至3、5、原始對照(pH為6.36)、7、9、11、13，避光4℃放置8 h，再調各組溶液的pH至中性，加入3倍體積的甲醇，震蕩搖勻并于室溫提取12 h后，減壓抽濾得到上清液，再取上清液經0.22 μm的微孔濾膜過濾，HPLC分別測定各組溶液中多拉菌素的質量濃度。各組均設3個重復，考察pH對多拉菌發酵液提取效果的影響。

1.4.3 發酵液的放置時間

取15組50 mL的多拉菌素發酵液，分別避光4℃放置2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144 h，加入3倍體積的甲醇，震蕩搖勻并于室溫提取12 h后，減壓抽濾得到上清液，再取上清液經0.22 μm的微孔濾膜過濾，HPLC分別測定各組溶液中多拉菌素的質量濃度。各組均設3個重復，考察不同放置時間對多拉菌發酵液提取效果的影響。

1.4.4 不同溫度

以具塞三角瓶分別取7組50 mL多拉菌素發酵液，分別置于不同溫度的水浴鍋:20、30、40、50、60、70、80℃，放置水浴鍋中8 h后，加入3倍體積的甲醇，震蕩搖勻并于室溫提取12 h后，減壓抽濾得到上清液，再取上清液經0.22 μm的微孔濾膜過濾，HPLC分別測定各組溶液中多拉菌素的質量濃度。各組設定3個重復，考察溫度對多拉菌素發酵液提取效果的影響。

1.5 不同因素對多拉菌素濃縮提取液的萃取效果的影響

1.5.1 萃取次數

取50 mL的多拉菌素發酵液的濃縮提取液，加入等體積的乙酸乙酯，分別萃取1、2、3次，合并每次的有機相，有機相經減壓濃縮干燥后加入50 mL的甲醇至完全溶解，取樣經0.22 μm的微孔濾膜過濾，HPLC分別測定其中多拉菌素的質量濃度，每組重復3次。考察不同萃取次數對多拉菌素的萃取效果的影響。

1.5.2 萃取試劑的體積

取6組50 mL的多拉菌素發酵液的濃縮提取液，加入不同體積的乙酸乙酯萃取，使V濃縮提取液∶

V乙酸乙酯分別為1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，取有機相減壓濃縮干燥后加入50 mL的甲醇至完全溶解，取樣經0.22 μm的微孔濾膜過濾，HPLC分別測定其中多拉菌素的質量濃度。每組設定3個重復，考察不同萃取體積對多拉菌素的萃取效果的影響。

1.6 發酵液中多拉菌素質量濃度的測定

“1.4”及“1.5”項下各實驗中多拉菌素的質量濃度的測定，均以“1.3”中多拉菌素的標準曲線求得，即以HPLC測定得到多拉菌素的峰面積，再由標準曲線得出其質量濃度。

1.7 多拉菌素的萃取率的計算

萃取率=(萃取溶劑中多拉菌素的總量/提取液中多拉菌素的總量)×100%

1.8 數據處理

數據均采用Originlab 8.0軟件進行分析和統計，每一個系數的顯著性通過Student t檢驗和P值來衡量。

2 結果與分析

2.1 多拉菌素標準曲線的繪制

以多拉菌素標準液的質量濃度與峰面積為橫縱坐標繪制標準曲線，得到其回歸方程:Y×10-4= 1.7623X－0.4938，線性相關系數為0.9998。該標準曲線顯示多拉菌素在線性范圍5～500 μg/mL范圍內具有良好的線性關系。根據此標準曲線能準確地得到多拉菌素的實際質量濃度。

2.2 不同因素對發酵液中多拉菌素提取效果的影響

2.2.1 不同的提取試劑

實驗表明不同的提取試劑效果差異顯著，以乙腈及甲醇的提取效果較好，它們提取得到多拉菌素的質量濃度分別為147.37 μg/mL和142.90 μg/ mL，但兩者差異不顯著(P＞0.05);同時，甲醇的成本及毒性均較乙腈低。故提取試劑選擇甲醇。

2.2.2 發酵液pH

圖1所示即為發酵液pH對多拉菌素提取效果的影響。由圖可以看出，在pH為3～11范圍內，多拉菌素比較穩定;但當發酵液pH為13時，多拉菌素已經無法被檢測出。這可能是由于在強堿性條件下，多拉菌素的結構發生改變，使得多拉菌素發生降解或變為其它未知物質，而不能被檢測出。多拉菌素在pH為3～11范圍內均較穩定，提取效果良好，故提取發酵液時不需要調節pH值。

圖1 發酵液pH對多拉菌素提取效果的影響Fig.1 Effects of pH on the extraction results of doramectin

2.2.3 發酵液的放置時間

發酵液放置時間對多拉菌素提取效果的影響見圖2。從圖2可以看出，在2～144 h內，發酵提取液中測得的多拉菌素的含量是趨于穩定的。所以，多拉菌素發酵液在避光條件下，放置一周是可行的。

圖2 發酵液放置時間對多拉菌素提取效果的影響Fig.2 Effects of storage time on the extraction results of doramectin

2.2.4 不同溫度

圖3所示即為溫度對多拉菌素提取效果的影響。如圖所示，在20～80℃條件下，均能提取得到多拉菌素，且提取液中多拉菌素的質量無顯著性差異(P＞0.05);且溫度的升高，有利于蛋白等雜質沉淀。故在20～80℃均能提取出多拉菌素，其在20～80℃條件下穩定，選定多拉菌素的提取溫度為40℃。

圖3 溫度對多拉菌素提取效果的影響Fig.3 Effects of temperature on textraction results of doramectin

2.3 不同因素對多拉菌素萃取效果的影響

2.3.1 萃取次數

隨著萃取次數的增加，萃取率也增大。萃取1次僅能達到89.41%，萃取2次可達98%，萃取2次和萃取3次的效果則沒有明顯的差異(P＞0.05)。故從成本及試劑回收的角度，選擇乙酸乙酯對多拉菌素的濃縮提取液萃取2次即可。

2.3.2 萃取試劑的體積

隨著設定比例中乙酸乙酯與濃縮提取液體積比的增大，萃取率也隨之增大。在實驗過程中，當萃取劑體積小于發酵液體積時，有明顯的乳化現象，待靜置較長時間分層后，測得萃取率為65.57%;當比例增大至2∶1時，萃取率增大至96.71%，與更大萃取體積得到的萃取率差異不顯著(P＞0.05)，所以綜合考慮選擇V乙酸乙酯∶V多拉菌素濃縮提取液為2∶1。

3 討論

本實驗考察了多因素對多拉菌素提取及萃取效果的影響。結果顯示，在對提取試劑優化實驗中，得到更為廉價和低毒的甲醇作為提取試劑。多拉菌素在設定的溫度、放置時間及pH為3～11的范圍內均較穩定。萃取實驗中以乙酸乙酯為萃取劑，優化得出其與多拉菌素濃縮提取液的體積比例為2∶1，萃取2次即可。

本實驗中發現，發酵液中多拉菌素在pH為3～11時穩定存在。在pH值為13時，檢測不到多拉菌素，故推測多拉菌素發生變化，降解至其它物質而不能被檢測到。提取試劑實驗中，乙腈極性較甲醇大，提取效果優于甲醇;但是乙腈成本及毒性也都較甲醇高，且兩者提取所得多拉菌素的質量濃度差異不顯著(P＞0.05);故選擇甲醇做完提取試劑。本文選擇3倍浸提試劑提取菌體，是由預實驗完成并在本文驗證，菌絲體經3倍甲醇浸提2次即可浸提完全。

1 Mckellar QA，Benchaoui HA.Avermecins and milbermycins.J Vet Pharmacol Ther，1996，19:331-351.

2 Mckellar QA.Developments in pharmacokinetics and pharmacodynamics of anthelmintic drugs.J Vet Pharmacol Ther，1997，20(suppl.1):10-19.

3Hu HB(扈洪波)，Zhu BL(朱蓓蕾)，Li JS(李俊鎖).Progress in research of avermectins.Chin J Anim Vet Sci(畜牧獸醫學報)，1999，(6):520-529.

4 Fang CL(房春林)，Yang GY(楊光友)，Gu XB(古小彬).Progress in research of doramectin.China Anim Husb Vet Med(中國畜牧獸醫)，2006，33:55-57.

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7 Harrison AC，Walker DK.Automated 96-well solid phase extraction for the determination of doramectin in cattle plasma.J Pharm Biomed Anal，1998，(16):777-783.

8 Hernando MD，Su'arez-Barcena JM，Bueno MJM，et al.Fast separation liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the confirmation and quantitative analysis of avermectin residues in food.J Chromatogr A，2007，(1155):62-73.

Extraction Conditions of Doramectin in Fermentation Broth of Streptomyces avermitilis

ZOU Ze-xian1，2，CHEN Xin1，ZHANG Xiao-lin2*1Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China;2Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037，China

The optimal extraction conditions of doramectin in fermentation broth of Streptomyces avermitilis were investigated by parallel experiments.Factors including distribution ratio of doramectin in fermentation broth(hyphae or supernatant)，extractants，extraction times，storage time，pH and temperature on extraction results were investigated with onefactor experiments.Meanwhile，the optimal extraction times and extracting volume were optimized based on using ethyl acetate.The optimal extraction conditions of doramectin in fermentation broth of Streptomyces avermitilis were obtained as follows:the optimal extraction solvent was methanol，and doramectin in fermentation broth could be stored for at least 144 h within the conditions of pH from 3 to 11 and temperature from 20 to 80℃.Using ethyl acetate to extract doramectin，twice was the optimal extracting time，and the twice volume of ethyl acetate and concentrated extract was the best extraction proportion.Under the optimal extraction conditions，the concentration of doramectin and its extraction rate were 151.78 μg/mL and 98.00%，respectively.

doramectin;fermentation broth;extraction condition

1001-6880(2012)01-0110-04

2011-02-17 接受日期:2011-08-31

國家“863”計劃高技術研究發展計劃資助項目“生物獸藥新產品研究和創制”(2006AA10A208-1)

*通訊作者 Tel:86-10-81763841;E-mail:zxl@chinagrain.org

R284.2

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