小鼠mdm2的表達及活性鑒定

王曉杜，趙阿勇，鄧緒芳，馬志永

(1.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 臨安311300；2.中國農業科學院 上海獸醫研究所，上海200241)

p53(腫瘤抑制因子)是細胞內信號轉導網絡中最重要的分子，它在細胞周期調控、DNA損傷修復、細胞衰老、細胞凋亡等方面具有重要功能，是最重要的腫瘤抑制因子[1]。p53作為轉錄激活因子，其活性受到自身修飾的影響，包括磷酸化、泛素化、乙酰化、甲酰化等[2]。mdm2(murine double minute 2，鼠雙微體基因-2)作為其主要的泛素化分子，主要功能是調節p53的泛素化和抑制p53轉錄活性。mdm2分子是一個調節p53泛素化的E3泛素化連接酶[3]。它是由1 476 bp編碼的，由491個氨基酸殘基組成的蛋白質，其結構包括p53綁定域、鋅指結構域、RING結構域、核定位和核輸出序列等不同功能域，在調節p53活性方面發揮重要作用[4]。mdm2調節p53活性表現在2個方面:一是增加p53蛋白泛素化以減少其穩定性；二是通過與p53綁定抑制轉錄活性[5]。細胞內恒量水平的p53發揮維持細胞穩態的作用，而當發生應激時，p53水平明顯升高，細胞為了防止其過分升高，建立起了一套調節p53活性的精巧機制，從而使細胞生存下去，mdm2就是這個過程中的主要負性調節因子之一[4]。因此，研究在應激條件下p53的功能，了解p53活性變化機制，建立一個mdm2抑制p53活性的細胞模型是十分重要的手段之一。本研究擬克隆小鼠Mus musculus的mdm2 cDNA，構建重組真核表達載體，并在哺乳動物細胞中表達，驗證該蛋白的E3連接酶活性和抑制p53活性的能力，建立mdm2抑制p53活性的細胞模型，為研究mdm2活性、mdm2與p53之間的相互作用和mdm2對p53活性調節等相關研究提供技術手段。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠3T3，H1299細胞株購于中國科學院上海細胞保藏中心。

質粒:p3xFLAG-CMV-7.1，pEGFP-N1-p53由浙江農林大學林業與生物技術學院實驗室保存。

常用的酶和試劑:AMV(avian myelobastosis virus，禽骨髓母細胞瘤病毒)反轉錄酶、PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應)擴增用Taq酶購自寶生物公司；lipofectamine 2 000轉染試劑購于Invitrogen公司；DMEM (Dulbecco’s modified eagle edium)和胎牛血清購于Gibco公司；ECL(ekectrochemiluminescens)發光試劑盒和BCA (bicinchoninic acid)試劑盒購于Pierce公司；質粒DNA中提試劑盒購于Nucleobond AX公司；Promega’s Steady-GloR螢光素酶檢測試劑盒購于Promega公司。

各種抗體:小鼠抗p53單克隆抗體(Do-1)，小鼠抗mdm2(SMP-14)，小鼠抗FLAG，小鼠抗GFP(green fluorescent protein，綠色熒光蛋白融合單鏈抗體)，小鼠抗β-actin抗體，HRP(horseradish peroxidase，辣根過氧化物酶)標記的羊抗小鼠IgG，HRP標記的羊抗兔IgG，TFITC(fluorescein isothiocyanate，異硫氰酸熒光素)標記的羊抗小鼠IgG等抗體購于Santa Cruz公司。

其他試劑采用國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及重組質粒的構建 刮取單層培養的小鼠3T3細胞樣品后，采用Trizol試劑盒提取細胞總核糖核酸(RNA)，利用olig(d)T作為反轉錄引物合成cDNA。以此cDNA為模板，利用引物(Forward:5′-TCTGAATTCGATGTGCAATACCAAC-3′，Reverse: 5′-GCGGTCGACCTAGTTGAAGTAAGTT-3′) 進 行PCR擴增mdm2基因的全長編碼區。PCR程序為:94℃5 min；94℃40 s，56℃40 s，72℃ 2min，運行35個循環；72℃10 min；10℃5 min。PCR產物分別用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后，與相應的雙酶切p3xFLAG-CMV-7.1載體相連接，轉化大腸埃希菌Escherichia coli DH5α。挑取單菌落擴大培養，然后分別用菌落PCR和質粒酶切鑒定陽性克隆，并將陽性克隆送去上海英駿生物公司進行DNA測序。結果表明:獲得mdm2的重組真核表達載體p3xFLAG-CMV-7.1-mdm2。

1.2.2 細胞轉染與蛋白免疫印跡(Western blotting) 真核表達質粒(p3xFLAG-CMV-7.1-mdm2和pEGFPN1-p53等)轉染細胞:取質粒2.0 g和2.0 L脂質體在200.0 L無血清培養基中混勻，室溫作用20 min；在六孔板中單層培養的H1299細胞長滿后，去掉培養液，PBS(phosphate buffer solution，磷酸鹽緩沖溶液)洗滌2次，然后，加入真核表達質粒和脂質體混合液，在37℃培養4～6 h后更換完全培養基，繼續培養24 h，然后按照下面方法收集各種細胞樣品。

培養細胞樣品的制備:去掉培養液，PBS洗滌2次，然后加1.0 mL PBS，用細胞刮鏟刮下細胞，收集細胞放入1.5 mL EP(epoxy epoxide，環氧樹脂)管中，4℃3 000 r°min－1離心5 min，小心去掉上清，－70℃保存或進行下一步操作。收集的細胞加入適量的裂解液，冰上裂解5 min，超聲裂解1～2 s，煮沸5 min，4℃離心10 min，轉移上清至新的EP管中。取2.0 L用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，加5×上樣緩沖溶液煮沸5 min，4℃高速離心10 min，取上清－20℃儲存。SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠)電泳和轉印:按照分子克隆實驗指南上的方法進行SDSPAGE，上樣30.0 μg°樣品－1，同時采用彩色預染蛋白質標記(marker)作為指示。電泳完成后，卸下凝膠浸泡在轉印緩沖液中，剪下與膠同樣大小的NC(nitrocellulose filter membrance，硝酸纖維素膜)膜和濾紙，在轉印緩沖液浸泡15～20 min。按照從負極到正極先濾紙—膠—NC膜—濾紙安裝好三明治夾心后，放在全濕轉印槽中，65 V恒壓轉印2～3 h。封閉、一抗及二抗處理:轉印完畢后，取下NC膜，放在50.0 g°L－1脫脂乳的 TBST(tris-buffered saline Tween-20)溶液(封閉液)中封閉 2 h，用含有 2.0 g°L－1Tween-20 的Tris(三羥甲基氨基甲烷)緩沖液(TBST洗滌緩沖液)洗滌2次(5 min°次－1)。加入1∶4 000稀釋的一抗(小鼠抗p53，小鼠抗FLAG，小鼠抗GFP，小鼠抗mdm2等)，4℃過夜輕搖振蕩。回收一抗后，NC膜用TBST洗滌3次，加入帶有HRP標記的羊抗小鼠二抗 (1:10 000稀釋)，室溫反應1 h，TBST洗滌5次。顯色:顯色利用ECL發光試劑盒在暗室中進行。試劑盒中A液和B液等體積混合后，滴在上述NC膜上，輕微搖動混勻5 min，放入暗盒中，然后壓上X光膠片，根據亮度確定曝光時間。曝光完成后，在顯影液中顯影待條帶出現后，放入定影液中定影2～3 min。膠片洗滌晾干后標記蛋白質標記，掃描膠片并進行剪輯。轉印(reblotting):上述顯完色的膜，加入5.0 mL脫膜緩沖液(reblotting buffer)或Stripping 緩沖液(100 mmol β-mercapto-ethanol，20.0 g°kg－1SDS，62.5 mmol Tris-Cl pH 6.8)，55 ℃反應 30 min，TBST洗滌2次后，加入封閉液，然后按照上述過程，更換一抗和二抗，可以進行第2次顯色。

1.2.3 間接免疫熒光染色 在蓋玻片上培養H1299細胞，轉染2.0 g的質粒24 h后，體積分數為4%甲醛 ∶體積分數為10%甲醇(1∶1)混合液固定30 min，PBS洗滌3次，37℃下用體積分數為1%NP40(乙基苯基聚乙二醇)處理30 min，PBS洗滌3次，100.0 g°L－1山羊血清37℃封閉30 min，PBS洗滌3次，1∶100比例稀釋的一抗(小鼠抗FLAG抗體)37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，羊抗小鼠FITC標記的二抗(1∶500)37℃孵育30 min，TBS洗滌3次，DAPI室溫染色10 min，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察目的蛋白表達和亞細胞定位情況。

1.2.4 熒光素酶活性測定 各種試驗質粒(pEGFP-N1-p53，p3xFLAG-CMV7.1-mdm2)和p53熒光素酶報告基因質粒(p53-Luc)，Rinna質粒(pRL-TK)，采用脂質體方法在H1299細胞上進行共轉染，24 h后收集細胞樣品，然后按照Promega公司雙熒光素酶報告系統檢測試劑盒的方法，在Modulus多功能檢測儀上檢測p53的相對熒光素酶活性，對獲得數據進行t檢驗等統計分析。

2 結果與分析

2.1 小鼠mdm2基因的克隆

由于在小鼠3T3細胞中，mdm2的mRNA表達很多，所以本試驗以該細胞為材料，提取其總RNA，反轉錄為cDNA，再以cDNA為模板，以1.1.1中的引物，PCR擴增獲得大約1 500 bp的片段(圖1)，以BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，把片段亞克隆到p3xFLAG-CMV-7.1真核表達載體上，酶切和測序結果表明:重組真核表達質粒p3xFLAG-CMV-7.1-mdm2構建成功(圖1)。所得序列經過NCBI(美國國家生物技術信息中心)上的Blast軟件比對，結果表明:本實驗所得到mdm2核苷酸序列與NCBI公布的小鼠 mdm2序列(NM_010786)100%同源。

圖1 重組表達質粒p3xFLAG-CMV7.1-mdm2的構建Figure 1 Construction of recombinant plasmid p3xFLAG-CMV7.1-mdm2

2.2 小鼠mdm2蛋白真核表達

重組真核表達質粒p3xFLAG-CMV7.1-mdm2和pEGFP-N1-p53轉染H1299細胞，采用蛋白免疫印跡(Western blotting)和間接免疫熒光方法檢測mdm2的表達和亞細胞定位，分別采用FLAG-vector(p3x-FLAG-CMV-7.1)，GFP-vector(pEGFP-N1)作為陰性對照，空載體FLAG-vector表達的FLAG片段太小無法檢測到，而GEP-vector能表達大約27 kDa蛋白。實驗結果表明:在Western-blotting試驗中，用抗FLAG抗體檢測FLAG-mdm2，在發現大約60 kDa有一條特異條帶(圖2)，抗p53(Do-1)抗體檢測GFP-p53，發現一條大約80 kDa處的特異性條帶 (GFP＋p53大小為79 kDa)。本試驗以GFP-p53蛋白表達作為對照，mdm2蛋白大小與文獻報道基本一致[3]。間接免疫熒光檢測中，利用小鼠抗FLAG抗體為一抗檢測FLAG-mdm2表達和定位，DAPI染細胞核。結果表明:mdm2主要在細胞核中表達(圖3)。mdm2蛋白具有核定位序列，這種細胞核定位可能與其綁定和調節p53活性的生理功能密切相關。

2.3 小鼠mdm2蛋白提高p53泛素化水平

mdm2作為E3連接酶，其主要功能體現在促進p53蛋白的泛素化，從而促進p53的降解，所以p53泛素化水平變化是衡量mdm2活性的重要手段。本試驗把p3xFLAG-CMV-7.1-mdm2和pEGFPN1-p53質粒按照一定量的比例轉染H1299細胞，轉染 8 h后添加泛素化酶抑制劑 MG132(10.0 g°mL－1)，18 h 后收集細胞樣品，以小鼠抗 p53(Do-1)抗體為一抗，Western blotting檢測p53泛素化水平。結果表明:在陰性對照中，p53泛素化水平幾乎沒有變化，這可能與mdm2在正常細胞中表達量低有關，而轉染表達mdm2細胞中，不但mdm2表達量較大，p53的泛素化水平也得到提高(圖4)。并且隨著mdm2表達量的增加，p53泛素化水平逐步增加，表明p53的泛素化對mdm2的表達水平表現出一定的依賴性。

圖2 Western blotting檢測FLAG-mdm2的表達Figure 2 Expression of recombinant protein FLAG-mdm2 detected by Western blotting

圖3 間接免疫熒光檢測FLAG-mdm2的表達和亞細胞定位Figure 3 Subcellular localization and expression of FLAG-mdm2 indicated by indirect immunofluorescence

2.4 小鼠mdm2蛋白抑制p53轉錄活性

mdm2的另一功能是抑制p53蛋白的轉錄活性，那么采用p53報告基因系統可以檢測mdm2調節p53活性的變化，從而判斷mdm2是否具有活性。本試驗把FLAG-vector(p3xFLAG-CMV-7.1)，GFP-vector(pEGFP-N1)，pEGFP-N1-p53，p3xFLAG-CMV7.1-mdm2，p53-Luc和內參質粒pRL-TK按照一定比例轉染H1299細胞，收集細胞樣品后，利用Promega公司的試劑盒檢測p53的相對轉錄活性，結果表明在無mdm2表達時，p53蛋白的轉錄活性較高，在有mdm2蛋白表達時，p53的轉錄活性較低(圖5)，驗證了mdm2對p53轉錄活性的抑制作用。因此，也證明我們克隆表達的鼠mdm2具有完整的生物學功能，建立了mdm2蛋白抑制p53活性的細胞模型。

3 討論

mdm2在細胞穩態調節中發揮重要作用，正是它的負向調節作用，控制了p53活性過高而損傷細胞。在人類腫瘤疾病中，7%是由于mdm2的過表達造成的，而且在mdm2啟動子的309位SNP(single-nucleotide polymorphism)能導致mdm2轉錄水平增加，從而導致該人群患腫瘤的幾率增加[6]。p53蛋白作為轉錄因子又能促進mdm2的轉錄和表達，形成一個負反饋調節環[7]。外界因素刺激機體或細胞可以改變它們之間的這種調節機制，打破該平衡之后果就是導致腫瘤的發生或疾病的蔓延與惡化[8]。因此，mdm2可以作為腫瘤治療的靶標，Nutlin 3a[9]，HLI98[10]是與 mdm2 結合的小分子，能夠干擾p53和mdm2之間的相互作用，具有治療腫瘤疾病潛在藥物的可能。病原微生物也能打破這種平衡，從而使其能夠逃逸機體的先天性免疫機能。如呼吸道合胞病毒[11]、人巨細胞病毒[12]、 流感病毒[13]等病毒能通過干擾 mdm2 和 p53 之間的相互作用調節p53活性，使p53的活性增加，進而使病毒復制免受機體先天性免疫機制的影響。

本研究從小鼠的3T3細胞中克隆了小鼠mdm2 cDNA，并把該基因編碼區亞克隆到真核表達質粒上，使重組FLAG-mdm2蛋白在哺乳動物細胞中得以表達，利用間接免疫熒光的方法觀測了重組蛋白的亞定位，發現mdm2主要定位在細胞核內，這可能與其參與p53活性調節的功能密切相關。mdm2的活性主要體現在提高p53泛素化水平和抑制p53轉錄活性[5]。本研究使mdm2和p53共表達，通過檢測p53的泛素化水平，發現mdm2能明顯提高p53泛素化水平，兩者之間具有一定的劑量依賴性。本文還利用報告基因系統驗證了mdm2抑制p53相對熒光素酶活性，從而證明本實驗成功構建了mdm2抑制p53活性的細胞模型。此模型，將為進一步研究mdm2活性和功能、mdm2與p53相互作用、p53活性位點突變等與p53活性調節的研究提供了工具，同時也為今后研究微生物因子干擾mdm2和p53相互作用，逃逸p53的抗病毒作用[14]和機體先天性免疫[15]相關研究提供了技術手段，為今后開展抗腫瘤藥物篩選、病毒致病機理等研究提供基礎。

圖4 FLAG-mdm2調節p53多泛素化Figure 4 Polyubiquitination of p53 in p3xFLAG-CMV-7.1-mdm2 transfected cells

圖5 mdm2抑制p53的轉錄活性Figure 5 Inhibitory effect of mdm2 on p53-mediated transcriptional activity by luciferase assay

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