滇牡丹內生真菌PR20的鑒定及次生代謝產物的研究

苗翠蘋，胡 娟，翟英哲，宋 飛，玄其存，陳有為，吳少華

云南大學云南省微生物研究所西南微生物多樣性教育部重點實驗室，昆明650091

滇牡丹內生真菌PR20的鑒定及次生代謝產物的研究

苗翠蘋，胡 娟，翟英哲，宋 飛，玄其存，陳有為，吳少華*

云南大學云南省微生物研究所西南微生物多樣性教育部重點實驗室，昆明650091

根據形態學特征和18S rDNA序列分析，將滇牡丹根中分離得到的內生真菌菌株PR20鑒定為高大毛殼Chaetomium elatum。利用柱色譜層析方法從該菌株的發酵產物中分離到5個化合物，通過理化性質及波譜數據分析，分別鑒定為7-羥基-4，6二甲基苯酞(1)、苔黑酚(2)、苔色酸(3)、間羥基苯甲酸(4)和次黃嘌呤核苷(5)，以上化合物均為首次從滇牡丹內生真菌中分離獲得。

滇牡丹;高大毛殼;7-羥基-4，6二甲基苯酞;苔黑酚;苔色酸

植物內生真菌在植物組織中普遍存在，并具有豐富的物種多樣性。一方面，它們是一類相對未開發的新資源，很有可能是新物種和新基因的豐富資源，而新基因和新物種通常又意味著產生新的天然產物［1］。另一方面，內生真菌與宿主植物之間存在著非常復雜的關系，能產生與宿主植物相同或相似的具有生理活性的次生代謝產物［2］。近年來，學者們對藥用植物內生真菌的研究非常活躍，國內外的相關報道越來越多。

我們曾報道了云南省嵩明縣滇牡丹植物內生真菌的分離、形態鑒定以及抗菌活性的篩選［3］。本文對具有抗菌活性的內生真菌菌株PR20進行了鑒定及其次生代謝產物的研究，通過形態學特征并結合18S rDNA序列分析，確定該菌株為毛殼菌屬的高大毛殼Chaetomium elatum，利用柱色譜層析方法從該菌株的發酵產物中分離獲得了5個化合物，根據理化性質及波譜數據分析，分別鑒定為7-羥基-4，6二甲基苯酞(1)、苔黑酚(2)、苔色酸(3)、間羥基苯甲酸(4)和次黃嘌呤核苷(5)。

1 材料

1.1 菌株來源

菌株PR20于2007年9月從滇牡丹的根中分離得到，現保存于云南大學云南省微生物研究所。

1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA):去皮馬鈴薯200 g煮沸30 min過濾，葡萄糖20 g，瓊脂12 g，加水定容至1000 mL，pH自然。查氏培養基:蔗糖30 g，硝酸鈉3 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，磷酸氫二鉀1 g，瓊脂12 g，水1000 mL。PDB培養基:去皮馬鈴薯200 g煮沸30 min過濾，葡萄糖20 g，加水定容至1000 mL，pH自然。

2 方法

2.1 菌株PR20的形態學特征

菌落形態特征:采用點植培養法，從斜面上蘸取極少量孢子以三點式接種于PDA培養基上，置于28℃恒溫箱中培養5～7 d后，觀察菌落的大小、表面紋飾、質地、邊緣、菌落顏色等。

顯微形態特征:采用插片培養法，將無菌的蓋玻片以30～45°斜插入PDA培養基中，然后接種培養數天，插片蓋在滴有蒸餾水的載玻片上于光學顯微鏡觀察其孢子形態、產孢結構等特征。

2.2 18SrDNA序列分析

采用CTAB法［4］提取基因組DNA。用18S rDNA序列通用擴增引物 5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'和5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'對菌株18S rDNA進行擴增。PCR反應體系如下:10× PCR Buffer+5 μL、100 μM each dNTP Mix 4 μL、0.25 μM正反向引物各1 μL、DNA模板1 μL、TaqDNA聚合酶0.3 U，用ddH2O補足至50 μL。反應程序為: 94℃預變性4 min，94℃變性1 min、56℃退火1 min和72℃延伸1 min，共30個循環。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離和純化后，由上海生工測序部完成測序工作。將獲得的18S rDNA序列數據經人工檢驗核定后，提交到GenBank中，利用NCBI數據庫中Blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對其進行相似序列檢索，利用Clustal X軟件［5］對獲得的相似序列進行多序列比對以及相似性分析，采用鄰接法用MEGA4.0軟件［6］進行系統發育樹的構建。

2.3 代謝產物的分離純化

從PDA斜面培養基上挑取菌絲接種于裝有50 mL PDB培養基的三角瓶中，28℃、200 r/min恒溫振蕩培養24 h后制成種子液，按2%的接種量將種子液接種至裝有140 mL發酵培養液的500 mL錐形瓶中，28℃、200 rpm恒溫振蕩培養7 d后，經過濾，分別收集菌體和發酵液，共發酵10 L。發酵液在45℃下減壓濃縮至2 L，用等體積乙酸乙酯萃取6次，萃取液減壓濃縮干燥后得提取物約6 g，菌絲體用甲醇浸泡超聲提取4次，收集濾液，濃縮蒸干得到菌體提取物約15 g，經過TLC檢測比較，將發酵液萃取物和菌體提取物合并后經硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(10∶0～6∶4)梯度洗脫，得到10個組分(Fr.1～Fr.10)。Fr.2經硅膠柱層析(石油醚-丙酮6∶1)和Sephadex LH-20凝膠柱層析(甲醇)分離得到化合物1(10 mg);Fr.3經硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯8∶2)和Sephadex LH-20凝膠柱層析(甲醇)分離得到化合物2(25 mg);Fr.4經硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯7∶3)和反向RP-18柱層析(甲醇-水8∶2)分離得到化合物3(44 mg);Fr.5經硅膠柱層析(氯仿-甲醇95∶5)和Sephadex LH-20凝膠柱層析(甲醇)分離得到化合物4(4 mg);Fr.7經硅膠柱層析(氯仿-甲醇5∶1)分離得到化合物5(7 mg)。

3 結果

3.1 菌株PR20形態學特征

菌株PR20在PDA培養基上菌落生長較快，28℃培養7 d后，菌落直徑約7 cm，灰白色，生長極為松散，四周菌絲匍匐狀，邊緣整齊。子囊殼表生，從菌落中心開始產生，子囊殼淺色成熟后變為橄欖綠色。在查氏培養基上菌落生長較慢，28℃培養10 d后，菌落直徑約7 cm，中間突起，菌落灰白色，邊緣整齊，子囊殼產生較慢。在光學顯微鏡下，菌株PR20菌絲交織，透明有隔。子囊殼球形，子囊殼壁膜質，呈不透明暗黑色，易破裂，表面著生兩種附屬絲，頂生附屬絲下部直，頂部螺旋狀卷曲，褐色，側生附屬絲直，漸細，褐色。子囊孢子褐色，橢圓形，檸檬形，壁厚，兩側平滑，兩端突起。產生厚垣孢子，在菌絲上間生或頂生。從形態上來看PR20屬于毛殼菌屬。

3.2 基于18S rDNA序列的系統發育分析

經PCR擴增后獲得的菌株PR20的18S rDNA序列長1709 bp，該序列與高大毛殼(序列號為M83257)在同一分支上，同源性為100%。

圖1 菌株PR20的顯微形態特征Fig.1 The morphological features of strain PR20

圖2 基于18S rDNA序列構建的菌株PR20與相關種之間的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 18S rDNA sequences of strain PR20 and related strains downloaded from Gen-Bank

綜合菌株PR20形態學特征和18S rDNA序列分析結果，本研究將菌株PR20鑒定為高大毛殼(Chaetomium elatum)。

3.3 化合物的結構鑒定

化合物1 無色針晶 (MeOH)。1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:7.65(1H，s，7-OH)，7.17 (1H，s，H-5)，5.18(2H，s，H-3)，2.24(3H，s，6-Me)，2.19(3H，s，4-Me);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:173.6(s，C-1)，152.9(s，C-7)，142.6(s，C-4a)，139.2(d，C-5)，125.2(s，C-6)，122.8(s，C-4)，110.3(s，C-7a)，70.2(t，C-3)，16.9(q，6-Me)，14.8(q，4-Me)。以上數據參照文獻［7］確定該化合物為7-羥基-4，6二甲基苯酞(7-hydroxy-4，6-dimethyl-phthalide)。

化合物2 無色針晶(MeOH)。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ:6.13(2H，s，H-2，6)，6.05 (1H，s，H-4)，2.16(1H，s，H-7);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:159.7(s，C-3)，159.7(s，C-5)，140.7 (s，C-1)，109.0(d，C-2)，109.0(d，C-6)，101.2(d，C-4)，20.2(q，C-7)。以上波譜數據與文獻［8］報道一致，確定其結構為苔黑酚(orcinol)。

化合物3 無色針晶(MeOH)。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ:6.18(1H，s，H-5)，6.13 (1H，s，H-3)，2.47(3H，s，H-8);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:175.4(s，C-7)，167.3(s，C-4)，164.1 (s，C-2)，145.7(s，C-6)，112.7(d，C-5)，106.0(s，C-1)，101.9(d，C-3)，24.6(q，C-8)。以上波譜數據與文獻［8］報道基本一致，確定其結構為苔色酸(orsellinic acid)。

化合物 4 無色晶體 (CHCl3)。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ:7.50(1H，d，J=7.1 Hz，H-6)，7.45(1H，s，H-2)，7.27(1H，t，J=7.1 Hz，H-5)，7.01(1H，d，J=7.6 Hz，H-4);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ:170.5(s，C-7)，159.0(s，C-1)，133.5(s，C-3)，130.9(d，C-5)，122.4(d，C-4)，121.5(d，C-6)，117.7(d，C-2)。以上波譜數據與文獻［9］報道基本一致，確定其結構為間羥基苯甲酸(m-hydroxybenzoicacid)。

化合物5 白色粉末。1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:12.37(1H，s，6-OH)，8.34(1H，s，H-2)，8.07(1H，s，H-8)，5.88(1H，d，J=5.5 Hz，H-1')，5.47(1H，s，2'-OH)，5.19(1H，s，3'-OH)，5.07(1H，s，5'-OH)，4.49(1H，s，H-2')，4.14 (1H，s，H-3')，3.95(1H，s，H-4')，3.67(1H，d，J= 11.4 Hz，H-5'a)，3.50(1H，d，J=11.3 Hz，H-5' b);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:156.9(s，C-6)，148.5(s，C-4)，146.2(d，C-8)，139.0(d，C-2)，124.8(s，C-5)，87.9(d，C-1')，86.0(d，C-4')，74.5(d，C-2')，70.7(d，C-3')，61.7(t，C-5')。以上波譜數據與文獻［10］報道基本一致，確定其結構為次黃嘌呤核苷(inosine)。

圖3 化合物1～5的結構Fig.3 Structures of compounds 1-5

4 討論

本文根據菌株的形態特征和18S rDNA序列分析，將分離自滇牡丹植物的內生真菌菌株PR20鑒定為高大毛殼(Chaetomium elatum)。從該菌株的發酵產物中分離獲得了5個化合物，均為首次從滇牡丹內生真菌中分離獲得。7-羥基-4，6二甲基苯酞最早分離自唐菖蒲青霉(Penicillium gladioli)［11］。苔黑酚和苔色酸廣泛存在于地衣中，也曾經從煙曲霉(Aspergillus fumigatus)［12］和粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)［13］的發酵產物中獲得過，我們曾報道過從一株附球菌屬(Epicoccum sp.)印楝內生真菌的代謝產物中分離到這兩個化合物［7］，表明該類苯酚衍生物較廣泛地存在于不同種類的絲狀真菌中。上述3個化合物均為首次從毛殼菌屬真菌中分離得到。

1 Sun JQ(孫劍秋)，Guo LD(郭良棟)，Zang W(臧偉)，et al.Recent research advance in endophytic fungi of medicinal plant and diversity of active substance.Acta Bot Boreal Occident Sin(西北植物學報)，2006，26:1505-1519.

2 Li X(李想)，Yao YH(姚燕華)，Sun GZ(孫光芝)，et al.Chemical constituents from marine-derived fungus of Penicillium sp.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2007，19:804-806.

3Miao CP(苗翠蘋)，Yu Y(余瑩)，Chen YW(陳有為)，et al.Study on isolation of endophytic fungi from Paeonia delavayi and their antimicrobial activity.Chin Pharm J(中國藥學雜志)，2011，46:738-741.

4 Guo LD，Hyde KD，Liew EY.Detection and taxonomic placement of endophytic fungi within frond tissues of Livistona chinensis based on rDNA sequences.Mol Phylogenet Evol，2001，20:1-13.

5 Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，et al.The CLUSTAL X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Res，1997，25:4876-4882.

6 Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4:Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0.Mol Biol Evol，2007，24:1596-1599.

7 Duncanson LA，Grove JF，Zealley J.Infra-red spectroscopy and structural chemistry.Part V.Hydroxyphthalides.J Chem Soc，1953，1331-1333.

8Wang LD(王立東)，Wu SH(吳少華)，Chen YW(陳有為)，et al.Studies on the secondary metabolites of endophytic fungus Epicoccum sp.isolated from Azadirachta indica.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2009，21:916-918.

9 Wen J(溫晶)，Shi HM(史海明)，Zan K(昝珂)，et al.Study on chemical constituents of Herba Artemisiae Anomalae.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2010，41:870-873.

10 Chang Q(常琪)，Chen DH(陳迪華)，Si JY(斯建勇)，et al.Study on chemical constituents of Acanthopanax giraldii Harms var.hispidus Hoo.China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，1993，18:162-164.

11 Raistrick H，Ross DJ.Dihydrogladiolic acid，a metabolic product of Penicillium gladioli machacek.Biochem J，1952，50:635-647.

12 Packter NM.Studies on the biosynthesis of phenols in fungi.Conversion of［14C］orsellinic acid and［14C］orcinol into fumigatol by Aspergillus fumigatus I.M.I.89353.Biochem J，1966，98:353-359.

13 Packter NM，Steward MW.Studies on the biosynthesis of phenols in fungi.Biosynthesis of 3，4-dimethoxy-6-methyltoluquinol and gliorosein in Gliocladium roseum I.M.I.93065.Biochem J，1967，102:122-132.

Identification and Secondary Metabolites of Endophytic Fungus PR20 from Paeonia delavayi

MIAO Cui-ping，HU Juan，ZHAI Ying-zhe，SONG Fei，XUAN Qi-cun，CHEN You-wei，WU Shao-hua*
Key Laboratory of Microbial Diversity in Southwest China，Yunnan Institute of Microbiology，Yunnan University，Ministry of Education，Kunming 650091，China

The fungal strain PR20 isolated from the root of Paeonia delavayi was identified as Chaetomium elatum based on morphological features and 18S rDNA sequence analysis.Five compounds were obtained from the fermentation broth of the strain，and their structures were identified as 7-hydroxy-4，6-dimethyl-phthalide(1)，orcinol(2)，orsellinic acid (3)，m-hydroxybenzoic acid(4)and inosine(5)，by means of their physic-chemical properties and spectroscopic methods.All compounds were reported from the endophytic fungus of P.delavayi for the first time.

Paeonia delavayi;Chaetomium elatum;7-hydroxy-4，6-dimethyl-phthalide;orcinol;orsellinic acid

1001-6880(2012)10-1339-04

2011-12-23 接受日期:2012-03-14

國家自然科學基金(20772105，21062027，20502021);云南省應用基礎研究基金(2010CD009);云南省中青年學術技術帶頭人后備人才基金(2008PY028);云南省教育廳科學研究基金(2010Z054);云南大學校基金(2010YB001)

*通訊作者 Tel:86-871-5032423;E-mail:shwu123@126.com

R284.2

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