滇牡丹內(nèi)生真菌PR20的鑒定及次生代謝產(chǎn)物的研究

苗翠蘋，胡 娟，翟英哲，宋 飛，玄其存，陳有為，吳少華

云南大學(xué)云南省微生物研究所西南微生物多樣性教育部重點實驗室，昆明650091

滇牡丹內(nèi)生真菌PR20的鑒定及次生代謝產(chǎn)物的研究

苗翠蘋，胡 娟，翟英哲，宋 飛，玄其存，陳有為，吳少華*

云南大學(xué)云南省微生物研究所西南微生物多樣性教育部重點實驗室，昆明650091

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和18S rDNA序列分析，將滇牡丹根中分離得到的內(nèi)生真菌菌株P(guān)R20鑒定為高大毛殼Chaetomium elatum。利用柱色譜層析方法從該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離到5個化合物，通過理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)分析，分別鑒定為7-羥基-4，6二甲基苯酞(1)、苔黑酚(2)、苔色酸(3)、間羥基苯甲酸(4)和次黃嘌呤核苷(5)，以上化合物均為首次從滇牡丹內(nèi)生真菌中分離獲得。

滇牡丹;高大毛殼;7-羥基-4，6二甲基苯酞;苔黑酚;苔色酸

植物內(nèi)生真菌在植物組織中普遍存在，并具有豐富的物種多樣性。一方面，它們是一類相對未開發(fā)的新資源，很有可能是新物種和新基因的豐富資源，而新基因和新物種通常又意味著產(chǎn)生新的天然產(chǎn)物［1］。另一方面，內(nèi)生真菌與宿主植物之間存在著非常復(fù)雜的關(guān)系，能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的具有生理活性的次生代謝產(chǎn)物［2］。近年來，學(xué)者們對藥用植物內(nèi)生真菌的研究非常活躍，國內(nèi)外的相關(guān)報道越來越多。

我們曾報道了云南省嵩明縣滇牡丹植物內(nèi)生真菌的分離、形態(tài)鑒定以及抗菌活性的篩選［3］。本文對具有抗菌活性的內(nèi)生真菌菌株P(guān)R20進(jìn)行了鑒定及其次生代謝產(chǎn)物的研究，通過形態(tài)學(xué)特征并結(jié)合18S rDNA序列分析，確定該菌株為毛殼菌屬的高大毛殼Chaetomium elatum，利用柱色譜層析方法從該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得了5個化合物，根據(jù)理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)分析，分別鑒定為7-羥基-4，6二甲基苯酞(1)、苔黑酚(2)、苔色酸(3)、間羥基苯甲酸(4)和次黃嘌呤核苷(5)。

1 材料

1.1 菌株來源

菌株P(guān)R20于2007年9月從滇牡丹的根中分離得到，現(xiàn)保存于云南大學(xué)云南省微生物研究所。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):去皮馬鈴薯200 g煮沸30 min過濾，葡萄糖20 g，瓊脂12 g，加水定容至1000 mL，pH自然。查氏培養(yǎng)基:蔗糖30 g，硝酸鈉3 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，磷酸氫二鉀1 g，瓊脂12 g，水1000 mL。PDB培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g煮沸30 min過濾，葡萄糖20 g，加水定容至1000 mL，pH自然。

2 方法

2.1 菌株P(guān)R20的形態(tài)學(xué)特征

菌落形態(tài)特征:采用點植培養(yǎng)法，從斜面上蘸取極少量孢子以三點式接種于PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7 d后，觀察菌落的大小、表面紋飾、質(zhì)地、邊緣、菌落顏色等。

顯微形態(tài)特征:采用插片培養(yǎng)法，將無菌的蓋玻片以30～45°斜插入PDA培養(yǎng)基中，然后接種培養(yǎng)數(shù)天，插片蓋在滴有蒸餾水的載玻片上于光學(xué)顯微鏡觀察其孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征。

2.2 18SrDNA序列分析

采用CTAB法［4］提取基因組DNA。用18S rDNA序列通用擴(kuò)增引物 5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'和5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'對菌株18S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下:10× PCR Buffer+5 μL、100 μM each dNTP Mix 4 μL、0.25 μM正反向引物各1 μL、DNA模板1 μL、TaqDNA聚合酶0.3 U，用ddH2O補足至50 μL。反應(yīng)程序為: 94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min、56℃退火1 min和72℃延伸1 min，共30個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離和純化后，由上海生工測序部完成測序工作。將獲得的18S rDNA序列數(shù)據(jù)經(jīng)人工檢驗核定后，提交到GenBank中，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中Blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對其進(jìn)行相似序列檢索，利用Clustal X軟件［5］對獲得的相似序列進(jìn)行多序列比對以及相似性分析，采用鄰接法用MEGA4.0軟件［6］進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2.3 代謝產(chǎn)物的分離純化

從PDA斜面培養(yǎng)基上挑取菌絲接種于裝有50 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后制成種子液，按2%的接種量將種子液接種至裝有140 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，28℃、200 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)7 d后，經(jīng)過濾，分別收集菌體和發(fā)酵液，共發(fā)酵10 L。發(fā)酵液在45℃下減壓濃縮至2 L，用等體積乙酸乙酯萃取6次，萃取液減壓濃縮干燥后得提取物約6 g，菌絲體用甲醇浸泡超聲提取4次，收集濾液，濃縮蒸干得到菌體提取物約15 g，經(jīng)過TLC檢測比較，將發(fā)酵液萃取物和菌體提取物合并后經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(10∶0～6∶4)梯度洗脫，得到10個組分(Fr.1～Fr.10)。Fr.2經(jīng)硅膠柱層析(石油醚-丙酮6∶1)和Sephadex LH-20凝膠柱層析(甲醇)分離得到化合物1(10 mg);Fr.3經(jīng)硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯8∶2)和Sephadex LH-20凝膠柱層析(甲醇)分離得到化合物2(25 mg);Fr.4經(jīng)硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯7∶3)和反向RP-18柱層析(甲醇-水8∶2)分離得到化合物3(44 mg);Fr.5經(jīng)硅膠柱層析(氯仿-甲醇95∶5)和Sephadex LH-20凝膠柱層析(甲醇)分離得到化合物4(4 mg);Fr.7經(jīng)硅膠柱層析(氯仿-甲醇5∶1)分離得到化合物5(7 mg)。

3 結(jié)果

3.1 菌株P(guān)R20形態(tài)學(xué)特征

菌株P(guān)R20在PDA培養(yǎng)基上菌落生長較快，28℃培養(yǎng)7 d后，菌落直徑約7 cm，灰白色，生長極為松散，四周菌絲匍匐狀，邊緣整齊。子囊殼表生，從菌落中心開始產(chǎn)生，子囊殼淺色成熟后變?yōu)殚蠙炀G色。在查氏培養(yǎng)基上菌落生長較慢，28℃培養(yǎng)10 d后，菌落直徑約7 cm，中間突起，菌落灰白色，邊緣整齊，子囊殼產(chǎn)生較慢。在光學(xué)顯微鏡下，菌株P(guān)R20菌絲交織，透明有隔。子囊殼球形，子囊殼壁膜質(zhì)，呈不透明暗黑色，易破裂，表面著生兩種附屬絲，頂生附屬絲下部直，頂部螺旋狀卷曲，褐色，側(cè)生附屬絲直，漸細(xì)，褐色。子囊孢子褐色，橢圓形，檸檬形，壁厚，兩側(cè)平滑，兩端突起。產(chǎn)生厚垣孢子，在菌絲上間生或頂生。從形態(tài)上來看PR20屬于毛殼菌屬。

3.2 基于18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得的菌株P(guān)R20的18S rDNA序列長1709 bp，該序列與高大毛殼(序列號為M83257)在同一分支上，同源性為100%。

圖1 菌株P(guān)R20的顯微形態(tài)特征Fig.1 The morphological features of strain PR20

圖2 基于18S rDNA序列構(gòu)建的菌株P(guān)R20與相關(guān)種之間的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 18S rDNA sequences of strain PR20 and related strains downloaded from Gen-Bank

綜合菌株P(guān)R20形態(tài)學(xué)特征和18S rDNA序列分析結(jié)果，本研究將菌株P(guān)R20鑒定為高大毛殼(Chaetomium elatum)。

3.3 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無色針晶 (MeOH)。1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:7.65(1H，s，7-OH)，7.17 (1H，s，H-5)，5.18(2H，s，H-3)，2.24(3H，s，6-Me)，2.19(3H，s，4-Me);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:173.6(s，C-1)，152.9(s，C-7)，142.6(s，C-4a)，139.2(d，C-5)，125.2(s，C-6)，122.8(s，C-4)，110.3(s，C-7a)，70.2(t，C-3)，16.9(q，6-Me)，14.8(q，4-Me)。以上數(shù)據(jù)參照文獻(xiàn)［7］確定該化合物為7-羥基-4，6二甲基苯酞(7-hydroxy-4，6-dimethyl-phthalide)。

化合物2 無色針晶(MeOH)。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ:6.13(2H，s，H-2，6)，6.05 (1H，s，H-4)，2.16(1H，s，H-7);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:159.7(s，C-3)，159.7(s，C-5)，140.7 (s，C-1)，109.0(d，C-2)，109.0(d，C-6)，101.2(d，C-4)，20.2(q，C-7)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報道一致，確定其結(jié)構(gòu)為苔黑酚(orcinol)。

化合物3 無色針晶(MeOH)。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ:6.18(1H，s，H-5)，6.13 (1H，s，H-3)，2.47(3H，s，H-8);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:175.4(s，C-7)，167.3(s，C-4)，164.1 (s，C-2)，145.7(s，C-6)，112.7(d，C-5)，106.0(s，C-1)，101.9(d，C-3)，24.6(q，C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報道基本一致，確定其結(jié)構(gòu)為苔色酸(orsellinic acid)。

化合物 4 無色晶體 (CHCl3)。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ:7.50(1H，d，J=7.1 Hz，H-6)，7.45(1H，s，H-2)，7.27(1H，t，J=7.1 Hz，H-5)，7.01(1H，d，J=7.6 Hz，H-4);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ:170.5(s，C-7)，159.0(s，C-1)，133.5(s，C-3)，130.9(d，C-5)，122.4(d，C-4)，121.5(d，C-6)，117.7(d，C-2)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報道基本一致，確定其結(jié)構(gòu)為間羥基苯甲酸(m-hydroxybenzoicacid)。

化合物5 白色粉末。1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:12.37(1H，s，6-OH)，8.34(1H，s，H-2)，8.07(1H，s，H-8)，5.88(1H，d，J=5.5 Hz，H-1')，5.47(1H，s，2'-OH)，5.19(1H，s，3'-OH)，5.07(1H，s，5'-OH)，4.49(1H，s，H-2')，4.14 (1H，s，H-3')，3.95(1H，s，H-4')，3.67(1H，d，J= 11.4 Hz，H-5'a)，3.50(1H，d，J=11.3 Hz，H-5' b);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:156.9(s，C-6)，148.5(s，C-4)，146.2(d，C-8)，139.0(d，C-2)，124.8(s，C-5)，87.9(d，C-1')，86.0(d，C-4')，74.5(d，C-2')，70.7(d，C-3')，61.7(t，C-5')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報道基本一致，確定其結(jié)構(gòu)為次黃嘌呤核苷(inosine)。

圖3 化合物1～5的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of compounds 1-5

4 討論

本文根據(jù)菌株的形態(tài)特征和18S rDNA序列分析，將分離自滇牡丹植物的內(nèi)生真菌菌株P(guān)R20鑒定為高大毛殼(Chaetomium elatum)。從該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得了5個化合物，均為首次從滇牡丹內(nèi)生真菌中分離獲得。7-羥基-4，6二甲基苯酞最早分離自唐菖蒲青霉(Penicillium gladioli)［11］。苔黑酚和苔色酸廣泛存在于地衣中，也曾經(jīng)從煙曲霉(Aspergillus fumigatus)［12］和粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)［13］的發(fā)酵產(chǎn)物中獲得過，我們曾報道過從一株附球菌屬(Epicoccum sp.)印楝內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物中分離到這兩個化合物［7］，表明該類苯酚衍生物較廣泛地存在于不同種類的絲狀真菌中。上述3個化合物均為首次從毛殼菌屬真菌中分離得到。

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Identification and Secondary Metabolites of Endophytic Fungus PR20 from Paeonia delavayi

MIAO Cui-ping，HU Juan，ZHAI Ying-zhe，SONG Fei，XUAN Qi-cun，CHEN You-wei，WU Shao-hua*
Key Laboratory of Microbial Diversity in Southwest China，Yunnan Institute of Microbiology，Yunnan University，Ministry of Education，Kunming 650091，China

The fungal strain PR20 isolated from the root of Paeonia delavayi was identified as Chaetomium elatum based on morphological features and 18S rDNA sequence analysis.Five compounds were obtained from the fermentation broth of the strain，and their structures were identified as 7-hydroxy-4，6-dimethyl-phthalide(1)，orcinol(2)，orsellinic acid (3)，m-hydroxybenzoic acid(4)and inosine(5)，by means of their physic-chemical properties and spectroscopic methods.All compounds were reported from the endophytic fungus of P.delavayi for the first time.

Paeonia delavayi;Chaetomium elatum;7-hydroxy-4，6-dimethyl-phthalide;orcinol;orsellinic acid

1001-6880(2012)10-1339-04

2011-12-23 接受日期:2012-03-14

國家自然科學(xué)基金(20772105，21062027，20502021);云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金(2010CD009);云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才基金(2008PY028);云南省教育廳科學(xué)研究基金(2010Z054);云南大學(xué)校基金(2010YB001)

*通訊作者 Tel:86-871-5032423;E-mail:shwu123@126.com

R284.2

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