新疆大花紅景天化學成分的HPLC-MS研究

霍佳麗，王建華*，吳志軍，張國林

1重慶大學生物工程學院，重慶400044;2中國科學院成都生物研究所，成都610041

新疆大花紅景天化學成分的HPLC-MS研究

霍佳麗1，王建華1*，吳志軍2，張國林2

1重慶大學生物工程學院，重慶400044;2中國科學院成都生物研究所，成都610041

采用高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間串聯質譜法(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)，分別在正負離子模式下對新疆產大花紅景天(Rhodiola crenulata)提取物進行分離分析。通過精確質量測定和同位素峰形匹配(SigmaFit)確定了化合物的元素組成。在正離子模式下，選擇［M+H］+或［M+NH4］+準分子離子進行二級裂解對其結構進行分析。根據物質的元素組成和二級質譜信息，初步確定了新疆大花紅景天提取物中的12種化合物。

新疆大花紅景天;液質聯用(HPLC-MS);紅景天苷

景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola)植物全世界約有90種，中國有70多種，主要生長于高寒山區［1］。作為紅景天植物中研究較多的一種，大花紅景天(Rhodiola crenulata)具有促進人體新陳代謝，增強細胞活力，提高人體免疫等功效，可用來治療心衰、糖尿病、慢性肝病等疾病［2］。

根據目前國內外關于大花紅景天成分的研究報道［3-5］，其有效成分主要為紅景天苷及揮發油、黃酮、甾醇等。我們首次采用高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間串聯質譜法(HPLC-Q-TOF-MS)，對新疆大花紅景天根莖中的化學成分進行分離鑒別，ESI-Q-TOF-MS具有高分辨率，可獲得準確質量并產生多個可能分子式，再結合真實同位素分布模式SigmaFit算法，將實測同位素分布模式與理論計算的模式相比對，得到有統計意義的匹配因子——Sigma值，其值越小，說明同位素分布匹配性越好，據此可大大降低可能的分子式數目，進一步根據二級裂解碎片信息推測其結構，提供了一種快速、靈敏、準確的分離分析方法，旨在為合理開發利用大花紅景天這一寶貴的藥用植物資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent公司); ESI-Q-TOF質譜儀(Bruker公司);離心機(Anke);甲醇(色譜純，Fisher公司)，乙腈(色譜純，百靈威公司);醋酸銨(分析純，天津博迪化工有限公司);超純水;大花紅景天產自新疆清水河。

1.2 供試品溶液制備

取干燥新疆紅景天適量，采用超純水提取，濾液濃縮后依次用二氯甲烷、正丁醇分別萃取3次，合并水相萃取層，減壓濃縮得浸膏。取濃縮樣品少量溶于甲醇溶劑中，混勻，離心2 min，取上清液，制得待測樣品。

1.3 分析條件

色譜條件:Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm ×150 mm);流動相A(1000 mL超純水，0.5%甲醇，0.5%醋酸銨)，流動相B(乙腈)。梯度洗脫程序(0～6 min，流動相A:95%～92%;6～35 min，流動相A:92%～40%;35～40 min，流動相A:40%～20%);流速0.2 mL/min;柱溫25℃;進樣量15 μL。

質譜條件:電噴霧(ESI)離子源;ESI源電壓: -500 V，毛細管電壓:-4500 V(負離子模式下+4000 V)。霧化氣體:高純氮氣(0.3 bar);樣品進樣速度: 180 μL/h。干燥氣溫度:180℃。干燥氣流速:4.0 L/min。檢測模式:正負離子模式。

2 結果與討論

2.1 新疆大花紅景天的HPLC-ESI-MS分析

在上述色譜條件下，各色譜峰得到較好的分離，分別在質譜正負離子模式下得到紅景天苷等12個物質的準分子離子峰，如表1所示。其中化合物1、8、10、11和12正離子模式下得到［M+NH4］+準分子離子峰，其它的則為質子化的分子離子峰。12個物質在兩種模式下均獲得誤差較小的精確質量和較小的mSigma值(其值越小，同位素匹配性越好)，根據其精確質量及同位素峰型匹配值，結合相關參考文獻［6-8］已報道的大花紅景天成分，推測了其可能元素組成，分子式見表1。

表1 大花紅景天中主要成分HPLC-Q-TOF-MS分析Table 1 Analysis of Rhodiola crenulata by HPLC-Q-TOF-MS

2.2 新疆大花紅景天的HPLC-ESI-MS/MS分析

在tR=6.2 min和tR=18.9 min分別觀察到6號峰m/z 449.1054，12號峰m/z 466.2630準分子離子峰(見圖1)，結合它們相應的負離子峰分子量，判斷6號峰為［M+H］+，12號峰為［M+NH4］+，即兩個物質質荷比m/z均為448，可推測兩物質為新疆大花紅景天中1對同分異構體。根據其精確分子量及同位素峰型匹配性可確定其分子式分別為C21H20O11和C21H36O10，又對其準分子離子分別進行二級裂解，m/z 449主要得到m/z 303和 m/z 287碎片，m/z 466斷裂主要碎片峰為m/z 295、m/z 277、m/z 259、m/z 137，據此可推測6號為Rhodionin，12號為Sacranoside。

圖1 正離子模式下總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram mass spectrometry

表1的12種化合物中，2、3、4、6和7可能是具有類似結構的黃酮化合物(如圖2所示)，均容易丟失側鏈糖基。以化合物2為例，質子化的分子離子［M+H］+m/z 611容易依次失去1分子葡萄糖和1分子鼠李糖得到的m/z 449和m/z 303的碎片離子，圖3給出了相應的碎片峰。

3 結論

新疆大花紅景天的分離中，流動相采用水相(0.5%醋酸銨)和乙腈相梯度洗脫取得較好的分離效果和較好的質譜響應峰值。根據高分辨質譜精確的分子量和同位素峰型的匹配性，可以確定物質的分子式，再結合二級質譜碎片信息和大花紅景天化學成分的相關文獻報道，確認出12種化合物，其他的化合物還需進一步研究其化學結構。HPLC-ESIQ-TOF實現了復雜中藥成分快速分離分析，為大花紅景天指紋圖譜的優化及微量成分的快速分析提供了一種有效的分析方法。

1 Bai Z，Nan P，Zhong Y.Chemical composition of the essential oil of Rhodiola quadrifida from Xinjiang，China.Chem Nat Compd，2005，41:418-419.

2 Kanupriya，Prasad D，Ram SM，et al.Cytoprotective and antioxidant activity of Rhodiola imbricata against tert-butyl hydroperoxide induced oxidative injury in U-937 human macrophages.Mol Cell Biochem，2005，275:1-6.

3 Zhu MP(朱曼萍).Research of chemical composition and quality of Rhodiola crenulata.Beijing:Beijing University of Chinese Medicine(北京中醫藥大學)，MSc.2007.

4 Peng JN(彭江南)，Ma CY(馬成禹)，et alStudies on chemical constituents bigflower Rhodiola(Rhodiola crenulata).Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，1995，26:177-179.

5 Aleksanteri P，Jorma J，Ari T.Identification of flavonoids of Rhodiola rosea by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.J Chromatogr A，2006，1112:224-231.

6 Tao L，Hao Z.Identification and comparative determination of rhodionin in traditional Tibetan medicinal plants of fourteen Rhodiola species by high-performance liquid chromatography-photodiode array detection and electrospray ionizationmass spectrometry.Chem Pharm Bull，2008，56:807-814.

7 Huang H，Liang MJ，Jiang P，et al.Quality Evaluation of Rhodiola crenulata:Quantitative and Qualitative Analysis of Ten Main Components by HPLC.J Liq Chromatogr Relat Technol，2008，31:1324-1336.

8 Ari T，Jouko U.Fast screening method for the analysis of total flavonoid content in plants and foodstuffs by high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-offlight mass spectrometry with polarity switching.Rapid Commun Mass Spectrom，2004，18:3113-3122.

Analysis of Chemical Constituents of Rhodiola crenulata Using High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

HUO Jia-li1，WANG Jian-hua1*，WU Zhi-jun2，ZHANG Guo-lin21College of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China;2Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China

The extracts of Rhodiola crenulata in Xinjiang were investigated by high-performance liquid chromatography and electrospray quadrupole time-of-flight mass spectrometry(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)in both positive-and negative-ion mode.Elemental compositions of compounds were confirmed by accurate mass and isotope analysis(the value of SigmaFit).Tandem MS was further applied for the structural analysis in positive-ion mode，and protonated or NH+4adduct precursor ions were selected for the fragmentation experiments.Twelve compounds，including a pair of isomer，from the extracts of R.crenulata were identified or tentatively characterized based on elemental compositions and tandem mass spectra.

Rhodiola crenulata(Xinjiang);HPLC-MS;salidroside

1001-6880(2012)10-1405-03

2011-11-15 接受日期:2012-01-16

國家科技支撐計劃(2007BAD51B05)

*通訊作者 Tel:86-23-65102507;E-mail:wjh@cqu.edu.cn

R284.2

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