新疆大花紅景天化學(xué)成分的HPLC-MS研究

霍佳麗，王建華*，吳志軍，張國(guó)林

1重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044;2中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都610041

新疆大花紅景天化學(xué)成分的HPLC-MS研究

霍佳麗1，王建華1*，吳志軍2，張國(guó)林2

1重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044;2中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都610041

采用高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)，分別在正負(fù)離子模式下對(duì)新疆產(chǎn)大花紅景天(Rhodiola crenulata)提取物進(jìn)行分離分析。通過(guò)精確質(zhì)量測(cè)定和同位素峰形匹配(SigmaFit)確定了化合物的元素組成。在正離子模式下，選擇［M+H］+或［M+NH4］+準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級(jí)裂解對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。根據(jù)物質(zhì)的元素組成和二級(jí)質(zhì)譜信息，初步確定了新疆大花紅景天提取物中的12種化合物。

新疆大花紅景天;液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS);紅景天苷

景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola)植物全世界約有90種，中國(guó)有70多種，主要生長(zhǎng)于高寒山區(qū)［1］。作為紅景天植物中研究較多的一種，大花紅景天(Rhodiola crenulata)具有促進(jìn)人體新陳代謝，增強(qiáng)細(xì)胞活力，提高人體免疫等功效，可用來(lái)治療心衰、糖尿病、慢性肝病等疾病［2］。

根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于大花紅景天成分的研究報(bào)道［3-5］，其有效成分主要為紅景天苷及揮發(fā)油、黃酮、甾醇等。我們首次采用高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-Q-TOF-MS)，對(duì)新疆大花紅景天根莖中的化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒別，ESI-Q-TOF-MS具有高分辨率，可獲得準(zhǔn)確質(zhì)量并產(chǎn)生多個(gè)可能分子式，再結(jié)合真實(shí)同位素分布模式SigmaFit算法，將實(shí)測(cè)同位素分布模式與理論計(jì)算的模式相比對(duì)，得到有統(tǒng)計(jì)意義的匹配因子——Sigma值，其值越小，說(shuō)明同位素分布匹配性越好，據(jù)此可大大降低可能的分子式數(shù)目，進(jìn)一步根據(jù)二級(jí)裂解碎片信息推測(cè)其結(jié)構(gòu)，提供了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的分離分析方法，旨在為合理開發(fā)利用大花紅景天這一寶貴的藥用植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent公司); ESI-Q-TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司);離心機(jī)(Anke);甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)，乙腈(色譜純，百靈威公司);醋酸銨(分析純，天津博迪化工有限公司);超純水;大花紅景天產(chǎn)自新疆清水河。

1.2 供試品溶液制備

取干燥新疆紅景天適量，采用超純水提取，濾液濃縮后依次用二氯甲烷、正丁醇分別萃取3次，合并水相萃取層，減壓濃縮得浸膏。取濃縮樣品少量溶于甲醇溶劑中，混勻，離心2 min，取上清液，制得待測(cè)樣品。

1.3 分析條件

色譜條件:Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm ×150 mm);流動(dòng)相A(1000 mL超純水，0.5%甲醇，0.5%醋酸銨)，流動(dòng)相B(乙腈)。梯度洗脫程序(0～6 min，流動(dòng)相A:95%～92%;6～35 min，流動(dòng)相A:92%～40%;35～40 min，流動(dòng)相A:40%～20%);流速0.2 mL/min;柱溫25℃;進(jìn)樣量15 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧(ESI)離子源;ESI源電壓: -500 V，毛細(xì)管電壓:-4500 V(負(fù)離子模式下+4000 V)。霧化氣體:高純氮?dú)?0.3 bar);樣品進(jìn)樣速度: 180 μL/h。干燥氣溫度:180℃。干燥氣流速:4.0 L/min。檢測(cè)模式:正負(fù)離子模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 新疆大花紅景天的HPLC-ESI-MS分析

在上述色譜條件下，各色譜峰得到較好的分離，分別在質(zhì)譜正負(fù)離子模式下得到紅景天苷等12個(gè)物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子峰，如表1所示。其中化合物1、8、10、11和12正離子模式下得到［M+NH4］+準(zhǔn)分子離子峰，其它的則為質(zhì)子化的分子離子峰。12個(gè)物質(zhì)在兩種模式下均獲得誤差較小的精確質(zhì)量和較小的mSigma值(其值越小，同位素匹配性越好)，根據(jù)其精確質(zhì)量及同位素峰型匹配值，結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)［6-8］已報(bào)道的大花紅景天成分，推測(cè)了其可能元素組成，分子式見表1。

表1 大花紅景天中主要成分HPLC-Q-TOF-MS分析Table 1 Analysis of Rhodiola crenulata by HPLC-Q-TOF-MS

2.2 新疆大花紅景天的HPLC-ESI-MS/MS分析

在tR=6.2 min和tR=18.9 min分別觀察到6號(hào)峰m/z 449.1054，12號(hào)峰m/z 466.2630準(zhǔn)分子離子峰(見圖1)，結(jié)合它們相應(yīng)的負(fù)離子峰分子量，判斷6號(hào)峰為［M+H］+，12號(hào)峰為［M+NH4］+，即兩個(gè)物質(zhì)質(zhì)荷比m/z均為448，可推測(cè)兩物質(zhì)為新疆大花紅景天中1對(duì)同分異構(gòu)體。根據(jù)其精確分子量及同位素峰型匹配性可確定其分子式分別為C21H20O11和C21H36O10，又對(duì)其準(zhǔn)分子離子分別進(jìn)行二級(jí)裂解，m/z 449主要得到m/z 303和 m/z 287碎片，m/z 466斷裂主要碎片峰為m/z 295、m/z 277、m/z 259、m/z 137，據(jù)此可推測(cè)6號(hào)為Rhodionin，12號(hào)為Sacranoside。

圖1 正離子模式下總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram mass spectrometry

表1的12種化合物中，2、3、4、6和7可能是具有類似結(jié)構(gòu)的黃酮化合物(如圖2所示)，均容易丟失側(cè)鏈糖基。以化合物2為例，質(zhì)子化的分子離子［M+H］+m/z 611容易依次失去1分子葡萄糖和1分子鼠李糖得到的m/z 449和m/z 303的碎片離子，圖3給出了相應(yīng)的碎片峰。

3 結(jié)論

新疆大花紅景天的分離中，流動(dòng)相采用水相(0.5%醋酸銨)和乙腈相梯度洗脫取得較好的分離效果和較好的質(zhì)譜響應(yīng)峰值。根據(jù)高分辨質(zhì)譜精確的分子量和同位素峰型的匹配性，可以確定物質(zhì)的分子式，再結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜碎片信息和大花紅景天化學(xué)成分的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，確認(rèn)出12種化合物，其他的化合物還需進(jìn)一步研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)。HPLC-ESIQ-TOF實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜中藥成分快速分離分析，為大花紅景天指紋圖譜的優(yōu)化及微量成分的快速分析提供了一種有效的分析方法。

1 Bai Z，Nan P，Zhong Y.Chemical composition of the essential oil of Rhodiola quadrifida from Xinjiang，China.Chem Nat Compd，2005，41:418-419.

2 Kanupriya，Prasad D，Ram SM，et al.Cytoprotective and antioxidant activity of Rhodiola imbricata against tert-butyl hydroperoxide induced oxidative injury in U-937 human macrophages.Mol Cell Biochem，2005，275:1-6.

3 Zhu MP(朱曼萍).Research of chemical composition and quality of Rhodiola crenulata.Beijing:Beijing University of Chinese Medicine(北京中醫(yī)藥大學(xué))，MSc.2007.

4 Peng JN(彭江南)，Ma CY(馬成禹)，et alStudies on chemical constituents bigflower Rhodiola(Rhodiola crenulata).Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，1995，26:177-179.

5 Aleksanteri P，Jorma J，Ari T.Identification of flavonoids of Rhodiola rosea by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.J Chromatogr A，2006，1112:224-231.

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7 Huang H，Liang MJ，Jiang P，et al.Quality Evaluation of Rhodiola crenulata:Quantitative and Qualitative Analysis of Ten Main Components by HPLC.J Liq Chromatogr Relat Technol，2008，31:1324-1336.

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Analysis of Chemical Constituents of Rhodiola crenulata Using High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

HUO Jia-li1，WANG Jian-hua1*，WU Zhi-jun2，ZHANG Guo-lin21College of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China;2Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China

The extracts of Rhodiola crenulata in Xinjiang were investigated by high-performance liquid chromatography and electrospray quadrupole time-of-flight mass spectrometry(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)in both positive-and negative-ion mode.Elemental compositions of compounds were confirmed by accurate mass and isotope analysis(the value of SigmaFit).Tandem MS was further applied for the structural analysis in positive-ion mode，and protonated or NH+4adduct precursor ions were selected for the fragmentation experiments.Twelve compounds，including a pair of isomer，from the extracts of R.crenulata were identified or tentatively characterized based on elemental compositions and tandem mass spectra.

Rhodiola crenulata(Xinjiang);HPLC-MS;salidroside

1001-6880(2012)10-1405-03

2011-11-15 接受日期:2012-01-16

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2007BAD51B05)

*通訊作者 Tel:86-23-65102507;E-mail:wjh@cqu.edu.cn

R284.2

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