人腸道菌對黃芩苷的生物轉化

劉伶文，司 磊，任樹勇，劉永紅

西安工程大學西安710048

人腸道菌對黃芩苷的生物轉化

劉伶文*，司 磊，任樹勇，劉永紅

西安工程大學西安710048

本研究利用體外培養人體腸道菌轉化黃芩苷，探索轉化方法及模型;用醇沉法提取了黃芩苷轉化酶，即β-D-葡萄糖醛酸苷酶，并探討了酶促影響因素;通過高效液相色譜檢測產物黃芩素。經實驗確定，黃芩苷轉化培養液經超聲波處理后，在轉化液中有黃芩素檢出。實驗得知，轉化酶為胞內酶，該酶的最適反應溫度為55℃，最適pH為6.0，Ca2+、Mg2+和Cu2+對酶促反應具有促進作用，而Fe2+則具有抑制作用，Zn2+濃度在l mmol/L時起促進作用，在5 mmol/L時起抑制作用。

腸道菌;生物轉化;黃芩苷;超聲波處理;β-D-葡萄糖醛酸苷酶

絕大多數中草藥以口服為主，藥物中的有效成分在進入腸道之后與腸道菌群接觸，大多數要經相應腸道菌代謝轉化后被吸收。許多糖苷類藥物在腸道內吸收很差，要經腸道菌水解為相應的苷元才可被吸收［1］。

黃芩為一著名中藥，主要成分為黃芩苷(baicalin)，其次為黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用［2］。黃芩苷為一分子葡萄糖醛酸的黃酮衍生物，水解后為苷元黃芩素和葡萄糖醛酸。黃芩苷在腸道內難以被直接吸收，轉化為黃芩素才能被吸收入血液而發揮作用［3］。同時大量臨床藥效實驗證明，黃芩素的藥理作用強于黃芩苷［3］。

黃芩素的制備方法有兩種:一種是從中藥黃芩中分離提取;另一種是水解黃芩苷制備黃芩素。在黃芩中，黃芩苷含量是黃芩素的數十倍［4］，從黃芩中直接提取黃芩素回收率很低。車慶明［5］采用混合酸與黃芩苷混合加熱回流來制備黃芩素，能源消耗大，且嚴重污染環境。采用生物轉化法生產黃芩素反應溫和，易于控制，且無環境污染，汪紅［6］成功采用絲狀真菌—黑曲霉培養轉化黃芩苷為黃芩素。目前用人腸道菌轉化黃芩苷的研究還未見報道，本研究采用人體腸道菌體外培養轉化黃芩苷，建立轉化模型，為生物轉化黃芩苷制備黃芩素提供了一個新的途徑。

1 材料和儀器

1.1 實驗材料

黃芩苷，西安小草植物科技有限公司;黃芩素標準品，陜西省食品藥品檢驗所;硫乙醇酸鹽培養基，陜西省食品藥品檢驗所;維生素C，西安利君制藥有限責任公司;超純水，其他試劑為色譜純。

1.2 儀器

高效 液 相 色 譜 儀 (AgilentTechnoLogies-1200series);SK5200LH超聲波儀(上?？茖С晝x器有限公司);超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);高速離心機(Eppendorf Centrifuge 5810R); HZQ-F160全溫振蕩培養箱(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司);752N紫外可見分光光度儀(上海精科實業有限公司)。三洋低溫冰箱 MDFU5411—40℃(日本三洋)。HV-50高壓滅菌氣鍋(浙江科通儀器有限公司)

2 實驗內容

2.1 黃芩苷轉化方法及模型

2.1.1 人腸道菌培養轉化黃芩苷

稱取4.2 g硫乙醇酸鹽培養基，加水150 mL配制成液體培養基，加入黃芩苷5 g，煮沸后高壓滅菌，冷卻致室溫后加入2 g維生素C，配制成黃芩苷轉化培養基。人腸道菌群混合液制備參照文獻［7］:取健康人的新鮮糞便2 g，立即加入150 mL培養基中，充分攪拌后用3層紗布過濾，將濾液分裝于培養管中，采用套管法37℃恒溫振蕩培養72 hr。

2.1.2 超聲破碎處理方法

超聲波處理可能提高黃芩苷的分散度和溶解性，有利于被轉化酶轉化，也可能有破碎細菌細胞壁的作用，使細胞內的轉化酶釋放到胞外環境中，有利于黃芩苷的轉化。設計不同的超聲波處理方法，確定在人腸道菌體外培養轉化黃芩苷模型中合理的超聲波處理方法，以明確超聲波處理在此模型中的作用。設定超聲波頻率為40 KHz，處理時間為20 min，實驗設計見表1。

表1 超聲波處理方法設計Table 1 Design of ultrasonic treatment

將處理結束的黃芩苷轉化培養液于10 000 rpm下離心10 min，取上清液濃縮，然后用30 mL甲醇溶解，再次離心后取上清液待檢測。

2.1.3 代謝產物高效液相色譜檢測

分別取黃芩素標準品甲醇溶液(20 μg/mL)、各組樣品上清液，用高效液相色譜儀(Agilent TechnoL-ogies-1200series)進行檢測。色譜條件:流動相，甲醇∶水∶乙酸=65∶35∶0.2;波長，275 nm;流速，1.0 mL/min，柱溫，28℃，進樣量10 μL［8］。

2.2 黃芩苷轉化酶的酶學性質

2.2.1 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的提取

培養液經40 KHz超聲波破碎處理40 min［9］，4℃、10 000 rpm離心20 min，取上清液為粗酶液，于4℃冰箱保存。取10 mL粗酶液，加入1.5倍體積的-25℃乙醇，再次冷凍離心，取沉淀物溶于pH 6.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，低溫保存，為待測酶液。

2.2.2 酶活力的測定

酶活力的測定，可選用測定轉化液中黃芩苷的水解產物黃芩素含量的方法。黃芩素的測定選用紫外吸光光度法。黃芩素結構中A環上有5，6，7三羥基結構，在紫外光區279 nm處有最大吸收，可通過測定酶促反應后轉化液中黃芩素的含量來表示β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活性。

2.2.2.1 黃芩素紫外吸收標準曲線

以甲醇為溶劑，配制3.0 mg/mL的黃芩素標準品溶液，分別稀釋到40、50、60、80、100、125、160和200倍，將稀釋倍數換算為具體濃度，然后利用紫外分光光度計在279 nm處檢測其吸光度A值，以吸光度對溶液濃度作黃芩素的標準曲線。

2.2.2.2 酶活力的測定方法

取0.15 mol/L黃芩苷溶液0.5 mL和0.5 mL酶液，加入含1 mL pH 6.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的試管中。將試管置于50℃恒溫水浴中反應30 min。反應結束后，向反應體系中加入1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL終止反應，加入5 mL甲醇，微型漩渦混合儀混勻，在轉速10 000 rpm下離心時間10 min，離心結束后，取上清液用甲醇稀釋500倍備用。

以溶劑甲醇為空白參照，測定離心上清液中黃芩素的吸光度A值，根據黃芩素標準曲線，計算上清液中黃芩素的含量。以實驗條件下每分鐘釋放出1 μmol黃芩素所需要的酶量為1U。

2.2.3 酶促反應影響因素測定

測定反應溫度、pH值、金屬離子對酶促反應的影響，通過測定反應體系中酶活力的方法研究黃芩苷β-D-葡萄糖醛酸苷酶的酶學特性。

2.2.3.1 反應溫度對酶促反應的影響:分別在25、30、35、40、45、50、55、60、65℃條件下測定酶活力，根據其酶活力的大小確定其酶的最適水解溫度。

2.2.3.2 pH對酶促反應的影響∶配制一系列磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。測定不同pH下樣品的酶活力，根據其酶活力的大小確定酶的最適水解pH。

2.2.3.3 金屬離子對酶促反應的影響:實驗研究Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+和 Zn2+對 β-D-葡萄糖醛酸苷酶活性的影響。分別配制1 mmol/L和5 mmol/L的CaCl2、MgSO4、CuSO4、FeSO4和ZnSO4金屬鹽溶液，初步定性分析金屬離子對β-D-葡萄糖醛酸苷酶活性的影響。

3 結果分析

3.1 黃芩苷轉化方法實驗結果

黃芩素標準品、各實驗組的液相色譜圖分別見圖1、圖2、圖3和圖4。

由圖1可見黃芩素標準品主峰，其保留時間為14.1 min。圖2、3在此處無吸收峰，說明實驗培養液中未檢測出黃芩素。圖4在此處出現吸收峰，說明實驗轉化液中檢測到黃芩素。

A組實驗經過腸道菌培養轉化黃芩苷，未進行任何形式的超聲處理，無法收獲轉化物黃芩素。

B組實驗在接種前對含有黃芩苷的培養基進行超聲處理，旨在提高黃芩苷的分散度和溶解性，以利于黃芩苷被腸道細菌細胞吸收及轉化，提高轉化酶的轉化效率。但在轉化液中未檢測出黃芩素，說明在細菌胞外環境未發生黃芩苷的轉化，轉化可能發生在細胞內。這種超聲波處理的方法不能收獲黃芩苷。

C組實驗方法，腸道菌在黃芩苷轉化培養基中培養結束后，經超聲波處理，在轉化液中有黃芩素檢出，說明此種方法的處理可以提取到黃芩素。超聲波處理一方面可提高黃芩苷的分散度和溶解性，有利于被轉化酶轉化。更重要的是超聲波處理有破碎細菌細胞壁的作用，使細胞內的轉化酶釋放到胞外環境中，同時也使胞內發生轉化的黃芩素被釋放，可以從轉化液中獲取黃芩素。這種超聲波處理方法有利于黃芩苷的轉化和黃芩素的提取。從以上實驗結果比較也可以得出，黃芩苷轉化酶為胞內酶。

3.2 黃芩苷轉化酶的酶學性質

3.2.1 反應溫度對酶促反應的影響

實驗設定酶促反應溶液的pH值為6.5、其他條件不變時，只改變酶促反應的溫度，測定不同溫度下β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活性，結果見圖5。

圖5 反應溫度對酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity

由圖5可知，當溫度由25℃上升到55℃時，酶活力逐漸升高。溫度達到55℃，酶活力達到最高，繼續升高溫度，酶活力開始下降，當溫度升高到60℃時，酶活力急速下降。溫度升到70℃時，幾乎無法測出酶活，斷定蛋白質發生變性，酶已基本失活。實驗測定β-D-葡萄糖醛酸苷酶活力最適溫度為55℃。

3.2.2 pH值對酶促反應的影響

設定酶促反應溫度為55℃，其他條件不變，僅改變反應的pH值，測定不同pH值對酶活力的影響，見圖6所示。

由圖6可見，反應環境pH由3.5上升到5.5時，酶活力逐漸升高。pH達5.5時，酶活力達到最高，繼續升高pH，酶活力逐漸下降。測得的β-D-葡萄糖醛酸苷酶活力最適pH值為5.5。

3.2.3 金屬離子對酶促反應的影響

圖7 金屬離子對酶活力的影響Fig.7 Effect of metal ions on enzyme activity

設定環境反應溫度55℃，反應pH值為5.5，其他條件不變，以不含待測離子的β-D-葡萄糖醛酸苷酶的水解活性為100%，測定值與之相比較，得相對值，結果如圖7所示。圖中黑色圖柱為離子濃度1 mmol/L時酶活力，白色圖柱為離子濃度5 mmol/L是酶活力。斜線柱為未加金屬離子的空白對照。

由圖7可知，Ca2+、Mg2+和Cu2+對酶促反應具有促進作用，可作為酶促反應的激活劑;而Fe2+則具有抑制作用，可作為酶促反應的抑制劑;Zn2+在低濃度下起促進作用，在高濃度時起抑制作用。

4 結論

本研究建立了體外培養人腸道菌轉化黃芩苷的實驗模型，為生物轉化黃芩苷制備黃芩素提供了新的途徑和理論支持

研究表明黃芩苷經人腸道菌作用轉化為苷元黃芩素。對黃芩苷生物培養液進行超聲波破碎處理，轉化酶釋放后，促使黃芩苷轉化和利于提取黃芩素。

黃芩苷轉化過程中起轉化作用的是黃芩苷-β-D-葡萄糖醛酸苷酶，該酶的最適反應溫度為55℃，最適pH值為6.0，金屬離子Ca2+、Mg2+和Cu2+對酶促反應具有促進作用，而Fe2+則具有抑制作用，Zn2+在低濃度下起促進作用，高濃度時起抑制作用。實驗中用紫外分光光度法測定轉化液中黃芩素的含量來表示β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活性。

1Li YM(李詠梅)，Li XM(李曉眠)，Zhu Z(朱澤).Advances in biotransformation of glycosides from Chinese medicinal by human intestinal bacteria.World Chin J Digestology(世界華人消化雜志)，2008，16:2144-2148.

2 Mortia M，Takahashi I，Kanai M.BaicaLein 5，6，7-trimethyL-ether，a flavonoid derivative，stimulates fatty acid beta-oxidation in skin fibrobLasts of X-Linked adrenoLeukodystrophy.FEBS Lett，2005，579(2):40.

3 Muto R，Motozuka T，et al.The chemical structure of new substance as the metabolite of baicalin and time profiles for the plasma concentration after oral administration of sho-saiko-to in human.Yakugaku Zasshi，1998，118(3):79.

4 Fu H(符洪)，Xiao XY(肖新月)，et al.Determination and Chromatogram Recognition of Main Chemical Constituents in Radix Scutellariae of Different Resource.ChinJ Pharm Anal (藥物分析雜志)，2003，13:33-39.

5 Che QM(車慶明).A new preparation of baicalein(一種制備黃芩素的方法).CN02129372.4，2003，02:26.

6 Wang H(汪紅)，Gao P(高陪)，Liao Y(廖勇)，et al.The studies on the transformation from baicalin into baicalein by the microbial transformation.J Sichuan Univ，Nat Sci(四川大學學報，自科版)，2009，46:795-798.

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9 Liu TT(劉婷婷)，et al.Study on technology of ultrasonic-assisted extraction of superoxide dismutase from corn.Food Sci (食品科學)，2007，28:156-159.

10 Wang JF(王劍鋒)，et al.Purification and characterization of geniposide hydrolyzing β-glucosidase from Aspergillus niger.Mycosystema(菌物學報)，2010，29:683-690.

Biotransformation of Bacicalin by Human Intestinal Bacteria

LIU Ling-wen*，SI Lei，REN Shu-yong，LIU Yong-hong
Xi'an Polytechnic University，Xi’an 710048，China

The characteristic of human intestinal bacteria biotransformation system was studied.The enzyme(β-D-glucuronidase)was isolated by Alcohol precipitation，and the factors on enzymatic properties were analyzed.The product was identified as baicalein by high performance liquid chromatography(HPLC).After ultrasonic treatment on cultivation medium，the baicalein could be extracted.At pH 6.0 and 55℃，the activity of β-D-glucuronidase reached maximum，and was activated by Ca2+、Mg2+and Cu2+，but inhibited by Fe2+;at l mmol/L Zn2+played a catalytic role，but an inhibitory factor at 5 mmol/L.

intestinal bacteria;biotransformation;baicalin;ultrasonic treatment;β-D-glucuronidase

1001-6880(2012)10-1437-05

2012-02-22 接受日期:2012-05-24

陜西省教育廳專項科研項目(09JK453);陜西省科技廳工業攻關項目(2008k07-14)

*通訊作者 Tel:86-013310988359;Email:LingwenLiu1@sina.com

TQ 464

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