超聲輔助提取鳳丹籽總黃酮的工藝研究

吳 悠，李梅青*，孫 強，陳 健，吳計劃，王 芬

1安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽合肥230036;2北京同仁堂安徽中藥材有限公司，安徽銅陵244000

超聲輔助提取鳳丹籽總黃酮的工藝研究

吳 悠1，李梅青1*，孫 強1，陳 健1，吳計劃2，王 芬2

1安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽合肥230036;2北京同仁堂安徽中藥材有限公司，安徽銅陵244000

本文以經脫脂處理后的鳳丹籽為原料，在單因素實驗的基礎上，選取乙醇濃度、料液比、超聲時間和超聲功率為自變量，以總黃酮得率為響應值，采用Box-Behnken響應面設計分析方法優化鳳丹籽總黃酮的提取工藝。通過此模型得出:超聲時間對鳳丹籽總黃酮提取的影響最為顯著，超聲時間和乙醇濃度，超聲時間和料液比，超聲時間和超聲功率之間的交互作用顯著。模型預計鳳丹籽總黃酮提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度75%，料液比1:21 g/mL，超聲時間49 min，超聲功率240 w，在此條件下，總黃酮得率平均值為9.015 mg/g。

鳳丹籽;總黃酮;紫外分光光度法;超聲提取;Box-Behnken響應面設計

鳳丹(Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang)，即銅陵牡丹，屬江南牡丹品種群，主要產于銅陵順安鎮、鐘鳴鎮和蕪湖市南陵縣何灣鎮。由于上述地區獨特的土壤和氣候條件，所產的鳳丹皮被實踐證明為藥效最好的丹皮品種［1］，并于2006年列為“國家地理標志保護產品”［2］。鳳丹籽是鳳丹開花后結出的種子，銅陵地區年產量約為1500 t。但至今未對鳳丹籽資源進行開發和利用。目前，國內外對牡丹籽的研究主要集中于油脂成分提取和活性成分分析，文獻報道了牡丹籽中含有芍藥苷、木犀草素、芹菜素［3-5］等活性物質，尚未報道黃酮等活性成分的提取工藝及其相關研究。

前期研究表明，鳳丹籽中含有一定量的黃酮類物質。黃酮類化合物具有多種生物活性，如免疫激活、抗氧化、降血脂、降膽固醇及雌激素樣作用，正以其保健和藥用價值受到人們的高度關注［6-9］。為充分開發和利用鳳丹籽中生物活性成分，本研究采用超聲輔助溶劑法提取鳳丹籽中總黃酮，通過單因素試驗和Box-Behnken響應面優化提取工藝，并采用紫外分光光度法測定鳳丹籽總黃酮的含量，以期為合理開發利用鳳丹籽資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

鳳丹籽(北京同仁堂安徽中藥材有限公司提供)經洗凈、粉碎、過篩后，采用乙醚浸提12 h，置于50℃的烘箱中烘干，過40目篩備用。

蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號: 20110530，純度:99.9%);

無水乙醇、亞硝酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉、硝酸鋁等，以上均為分析純。

1.1.2 儀器

UV-1800型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;

RE52AA型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;

KQ-250DE型數控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制和標準曲線的繪制

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法［10］。分別配制濃度為100、200、400、600、800、1000 mg/L蘆丁標準液。加2.25 mL蒸餾水于試管中，取0.5 mL蘆丁標準液加入試管，加入0.15 mL 5%NaNO2，靜置6 min，加入0.3 mL 10%的AlCl3·6H2O，靜置5 min，加入1.0 mL 1 mol·L-1NaOH，振蕩均勻后在波長為510 nm下進行比色測定，繪制標準曲線。

所得數據經回歸處理，得到蘆丁含量C(mg/ L)與吸光度A的回歸方程為A=0.0102C+ 0.0029，R2=0.9993。結果表明:蘆丁濃度與吸光度在25 mg/L～1000 mg/L范圍內具良好的線性關系。

1.2.2 樣品溶液配制和總黃酮含量的測定方法

準確稱取一定質量脫脂鳳丹籽粉末于100 mL三角瓶中，分別加入一定量的提取溶劑，在一定超聲條件下提取2次，合并提取液，過濾2次，并在30℃的條件下旋轉蒸發，待溶液蒸干后，加30%乙醇溶液將其完全溶解，并定容于100 mL容量瓶中，作為待測液。準確量取0.5 mL待測液，操作同1.2.1項，測定其在510 nm處測定吸光度，代入回歸方程，計算總黃酮含量。

1.2.3 單因素試驗

采用超聲輔助提取，考察乙醇濃度、液料比、超聲功率、超聲時間對總黃酮得率的影響。通過固定上述任意三個影響因素的值，變化單一影響因素考證其對鳳丹籽總黃酮得率的影響。固定值分別為乙醇濃度70%、料液比1∶15 g/mL、超聲時間30 min、超聲功率225 w。

1.2.4 Box-Behnken響應面試驗設計

以鳳丹籽總黃酮得率(mg/g)為響應值，根據單因素試驗的結果設計出響應面分析實驗的因素水平編碼表，見表1。并采用Excel、Origin 7.5和Design Expert 7.0對試驗結果進行數據處理。

表1 因素水平編碼表Table 1 Experimental design of 4 factors and 3 levels in response surface method

表2 黃酮提取響應面分析設計方案及結果Table 2 Design scheme and results of response surface analysis on extraction of total flavones

21 0 0 0 0 8.813 22 0 0 -1 1 7.502 23 1 0 0 -1 8.045 24 0 1 1 0 7.915 25 -1 0 -1 0 7.893 26 0 -1 0 1 7.134 27 -1 1 0 0 7.626 28 1 1 0 0 7.021 29 0 0 0 0 8.700

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

按1.2.3方法，考察乙醇濃度在50%～100%范圍內每間隔10%的變化、料液比在1∶10 g/mL～1∶30 g/mL范圍內每間隔5 g/mL變化、超聲時間在10 min-60 min范圍內每間隔10 min變化、超聲功率在125 w～250 w范圍內每間隔25 w變化對總黃酮得率的影響。結果顯示，乙醇濃度為80%、液料比為1∶20 g/mL、提取時間為40 min、超聲波功率為225 w時，總黃酮得率最高。

2.2 Box-Behnken響應面試驗結果與分析

2.2.1 Box-Behnken響應面試驗設計及結果

根據單因素實驗結果，在1.2.4試驗設計中乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲功率的零水平分別為80%、1∶20 g/mL、40 min、225 w。Box-Behnken響應面試驗設計及總黃酮測定結果見表2。

2.2.2 響應面結果分析

通過軟件Design-Expert7.0對表2中的實驗數據進行二次多項式回歸擬合，建立二元多次回歸方程，Y=8.78+0.17X1+0.2X2+0.27X3+0.1X4+0.09X1X2+0.21X1X3-0.12X1X4+0.19X2X3+0.09X2X4+ 0.32X3X4-0.28-1.24-0.35-0.23，對該方程的回歸分析和方差分析如表3所示。

表3 回歸與方差分析結果Table 3 Regression analysis results of extraction parameter of total flavones

由表3可以看出，方程的因變量與自變量之間 線性關系明顯，該模型和失擬項均顯著，并且該模型R2=0.9752，=0.9504，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于此反應的理論推測。

由F值可以得到因子貢獻率為:X3＞X2＞X1＞X4，即:超聲時間＞料液比＞乙醇濃度＞超聲功率。各因素中X1，X2，X3，X4，X1X3，X2X3，X3X4，，，，達到了顯著水平(P＜0.0500)。其中，乙醇濃度同超聲時間，料液比同超聲時間，超聲時間同超聲功率存在著交互作用，交互作用的3D曲面如圖1，2，3所示，其中圖1為乙醇濃度同超聲時間交互作用的影響，圖2為料液比同超聲時間交互作用的影響，圖3為超聲時間同超聲功率交互作用的影響。

分析此回歸模型，得出提取鳳丹籽總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度75%，料液比1∶21 g/mL，超聲時間49 min，超聲功率240 w，在此條件下鳳丹籽總黃酮的提取率的預存值是9.005 mg/g。為檢驗響應面優化結果的可靠性，采用上述工藝條件對鳳丹籽總黃酮進行提取，實際測得的平均得率為9.015 mg/g，其相對誤差為0.11%，小于1%，因此該優化提取工藝參數準確可靠。

3 結論

采用超聲輔助溶劑法提取鳳丹籽中總黃酮，乙醇濃度、料液比、超聲時間和超聲功率均對總黃酮的提取有影響。其中，超聲時間對鳳丹籽總黃酮提取的影響最為顯著，超聲時間和乙醇濃度，超聲時間和料液比，超聲時間和超聲功率之間的交互作用也存在一定的顯著性。最佳工藝條件為:乙醇濃度75%，料液比1∶21 g/mL，超聲時間49 min，超聲功率240 w，此條件下，鳳丹籽總黃酮的平均提取率為9.015 mg/g。

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Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Total Flavonoids from Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang seed

WU You1，LI Mei-qing1*，SUN Qiang1，CHEN Jian1，WU Ji-hua2，WANG Fen21College of Tea＆Food Science＆Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China;2Anhui Branch of Beijing Tongrentang TCM Co.，Tongling 244000，China

Extraction conditions of total flavonoids from Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang seed with ethanol combining ultrasonic were studied.Through single factor and Box-Behnken response surface analytical method，the scope and combination of influencing factor on extraction yield of total flavonoids were confirmed.The response surface methodology was employed to evaluate the effects of alcohol concentration，solid to liquid ratio，ultrasonic extraction time，ultrasonic power and their interaction.Results showed that extraction time on the extraction yield of total flavonoids had a significant effect.The optimum conditions of flavonoid extraction were as follows:alcohol concentration 75%，Solid to liquid ratio 1∶21 g/mL，ultrasonic extraction time 49 min and ultrasonic power 240 w，in this condition，the extraction yield of total flavonoids was 9.015 mg/g.

Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang seed;total flavonoids;UV-spectrophotometry;ultrasonic-assisted;Box-Behnken response surface analytical method

1001-6880(2012)10-1454-05

2011-12-31 接受日期:2012-04-18

銅陵市科技局項目(2010GY14)

*通訊作者 E-mail:lmq@ahau.edu.cn

S567.1+5

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