生物大分子的硫酸化修飾及其生物活性的研究進展

成偉華，付國平，趙改紅，沙 勐，李燦鵬*

1云南大學化學科學與工程學院，昆明650091;2昆明醫學院第二附屬人民醫院，昆明650101

生物大分子的硫酸化修飾及其生物活性的研究進展

成偉華1，付國平2，趙改紅1，沙 勐1，李燦鵬1*

1云南大學化學科學與工程學院，昆明650091;2昆明醫學院第二附屬人民醫院，昆明650101

生物大分子經過硫酸化修飾后具有抗病毒、抗腫瘤、抗凝血和增強免疫功能等生物活性。本文就硫酸化生物大分子的制備方法和生物活性等進行了綜述。

生物大分子;硫酸化;抗凝血;抗病毒;抗腫瘤

生物大分子是生物體內參與細胞等各種生命活動的主要承擔者，如多糖、蛋白質、核酸，具有增強免疫、抗衰老、抗氧化、抗癌、抗風濕等作用［1-2］。硫酸化多糖、蛋白是多糖、蛋白等生物大分子中的羥基或氨基被硫酸基團取代形成的天然的或合成的硫酸化多糖、蛋白。由于引入了帶大量的負電荷硫酸根基團，使其生物活性得到很好的改善，如具有抗病毒、抗腫瘤、抗凝血和增強免疫等生物活性。天然的硫酸化多糖、蛋白是從植物、動物組織中提取得到的，如硫酸化海藻多糖、硫酸化礁膜多糖、肝素等。人工合成的硫酸化多糖、蛋白，如硫酸化殼聚糖、硫酸化葡聚糖、硫酸化木聚糖、硫酸化絲素蛋白等。硫酸化多糖、蛋白因具有抗氧化，抗病毒、抗腫瘤［2］等生物活性，近年來受到廣泛的關注。

近年來發現硫酸化多糖、蛋白具有抗凝血活性。肝素是一種酸性黏多糖，無論在體內還是體外，肝素的抗凝作用都很強，故為現在最廣泛應用的抗凝劑。肝素主要從動物的肝臟、小腸中提取，提取步驟比較的繁瑣，且使用肝素會引起自發性出血和誘導血小板減少的副作用。所以人工合成硫酸化多糖或蛋白來代替肝素是目前研究的熱點之一。本文將各種硫酸化生物大分子的制備方法、生物活性及其影響因素的研究進行綜述。

1 硫酸化生物大分子的制備

硫酸化多糖、蛋白等生物大分子的制備常用的方法有氯磺酸-吡啶法、濃硫酸法、超聲助合成法、微波助合成法、干燥加熱法等。

1.1 濃硫酸法

濃硫酸和有機溶劑加入多糖或蛋白在一定溫度下即可進行反應。Tamada［3］用濃硫酸的方法對絲素蛋白進行硫酸化修飾，其硫酸化效率為15.7%，紅外光譜顯示了硫酸根已被引入到絲素蛋白中，反應產物中硫酸根的含量為0.3 mmol/g，在樣品濃度達到20 mg/mL時，凝血時間可以延長至60 min以上。這種硫酸化方法，操作雖然簡單，但是反應效率不高且樣品非常容易受到分解。

1.2 氯磺酸-吡啶法

Henry等［4］發現在吡啶中用氯磺酸可以進行硫酸化反應，并確定了哪些氨基酸參與了反應，及其對反應的穩定性的影響。Tamada［5］應用該方法制備了硫酸化絲素蛋白。其硫酸化效率達到66.7%，在硫酸化絲素蛋白濃度達到1 mg/mL時，凝血時間可以延長至60 min以上，活化部分凝血活酶時間(APTT)可以延長到300 s。楊曦明等［6］用氯磺酸-吡啶法制備了白樹花多糖硫酸酯，產物硫酸根的取代度為1.41。硫酸化產物濃度在5 mg/mL的濃度下就有抗凝血作用，在10 mg/mL時，相當于150U肝素的抗凝血效果。耿越等［7］采用氯磺酸-吡啶法對馬尾松花粉多糖進行硫酸化修飾，反應產物的硫含量為15.1%，取代度為1.47。修飾后的多糖能抑制腫瘤細胞的增殖，同時也能改善清除自由基的效果。Huang等［8］改進該方法，即在氯磺酸中加入了甲酰胺，未使用吡啶，這樣可以把反應溫度從80℃下降到60℃，得到了硫含量為10.9%的硫酸化殼聚糖。13C NMR的結果表明:與對照樣品相比，硫酸化樣品中C-6的位移最大，說明在C-6位上的羥基硫酸化反應活性最大。Bae等［9］用氯磺酸-甲酰胺法制備硫酸化柑橘果膠，反應產物的硫含量達到2.68%，取代度為0.15，得到的硫酸化柑橘果膠的抗菌性比柑橘果膠相比明顯提高，柑橘果膠對費氏弧菌有20%的抑制作用，硫酸化柑橘果膠對對費氏弧菌有58%的抑制作用，說明硫酸化改善了柑橘果膠的抗菌性。Liu等［10］用氯磺酸-甲酰胺合成硫酸化茶藨子木層孔菌多糖，反應產物硫含量最高可達14.46%，取代度為2.02。硫酸化茶藨子木層孔菌多糖對于肝癌細胞(HepG2)比茶藨子木層孔菌多糖有更明顯的抑制作用。

運用氯磺酸-吡啶法對多糖、蛋白等生物大分子進行硫酸化反應，由于其操作比較簡單，產率高，應用比較廣泛。但是，氯磺酸-吡啶法制備硫酸化樣品時，使用了氯磺酸、吡啶、甲酰胺等有毒有機試劑，這樣可能會對環境造成影響。另外，氯磺酸是一種酸性很強的有機酸，其反應劇烈而難以控制。近年來，隨著綠色化學的興起，找到一種反應溫和，對環境污染小的硫酸化生物大分子的制備方法是目前研究的熱點之一。

1.3 超聲助合成法

Wong等［11］用超聲輔助合成法制備硫酸化凝膠多糖，得到了硫含量為2.59%的硫酸化凝膠多糖，而未進行超聲處理的硫酸化產物的硫含量只有0.58%。13C NMR的結果表明硫酸化后的凝膠多糖的骨架結構并沒有發生根本的改變。該方法雖然對設備有特殊的要求，但是應用超聲來輔助合成，反應溫和，有潛在的應用價值。

1.4 微波助合成法

Xing等［12］首先制備硫酸化試劑二甲基甲酰胺(DMF)-三氧化硫，然后把殼聚糖、DMF-甲酸混合液與DMF-三氧化硫混合，放入微波合成儀，調節一定的功率和反應時間(70～120 s)，反應得到的樣品的硫含量在13.7%～14.9%之間。Feng等［13］用微波輔助合成法制備了硫酸化蘑菇多糖，與傳統方法相比，合成硫酸化蘑菇多糖的硫取代度差別不大，但反應時間大幅度減少，研究結果表明硫酸化蘑菇多糖體外抗氧化性明顯增強，對白血病細胞的增殖有抑制作用。

1.5 干燥加熱法

最近，筆者的研究小組發現:多糖和蛋白在硫酸氫鹽存在和干燥加熱的條件下可以被硫酸化，該方法簡單、可大量制備，且制備過程中不使用有機溶劑，對環境污染小，屬于一種綠色的硫酸化方法［14，15］。

表1 各種硫酸化方法的比較Table 1 Comparation of various sulfation methods

2 生物活性

2.1 抗凝血

肝素是最常用的抗凝血劑，但是肝素是從動物組織中提取得到的，在治療中經常使用可能會有抗血小板活性，進而引起不正常的流血現象。而硫酸化絲素蛋白、多糖具有抗凝血活性且副作用很小，是替代肝素的潛在抗凝血劑。Tamada［5］制備的硫酸化絲素蛋白具有很好的抗凝血活性，當硫酸化絲素蛋白濃度達到1 mg/mL時，APTT可以延長到300 s。Bae等［9］制備得到硫酸化果膠，發現硫酸化果膠延長了PT、APTT，并且它的抗凝血活性是肝素的1/ 5左右。合成N-羧甲基化-3，6-二取代的硫酸化低分子殼聚糖具有與肝素相同的抗凝血活性且當加入血液后不影響細胞內的結構［16］。Vongchan等［17］制備了三種不同分子量的硫酸化殼聚糖具有很好的抗凝血活性，其抗凝血機理與肝素類似。

2.2 抗病毒

近期的研究表明，硫酸化多糖、蛋白具有抗病毒的性質，特別是抗HIV活性。Baba等［18］發現了一些硫酸化多糖，如硫酸化葡聚糖，硫酸化戊聚糖，硫酸化卡拉膠等，對單純皰疹病毒、人巨細胞病毒等病毒有明顯的抑制作用。Lu等［19］合成了九種硫酸化淫羊藿多糖，發現硫酸化淫羊藿多糖對傳染性法氏囊病病毒感染細胞有很好的抑制作用，其機理是硫酸根吸附含有在陽離子病毒的表面，阻止了病毒的吸附和進入正常細胞。Uryu等［20］合成了中等分子量的硫酸烷基單糖，硫酸化單糖在0.4～0.7 mg/mL時，體外對HIV病毒的抑制率達50%。肝素作為抗凝血劑廣泛應用，隨后的研究發現經過硫酸化修飾后的肝素抗HIV的活性顯著增強，它主要是通過抑制HIV的復制來達到抗HIV的效果。進一步研究發現硫酸根取代度高的肝素抑制HIV-1型病毒活性更好，高抑制HIV-1型病毒的肝素有望應用到臨床上，可以和其他藥物一起治療艾滋病和HIV感染者［21-23］。關于硫酸化多糖的抗HIV的作用機制，徐文清［24］做了如下總結:1)干擾HIV-1對宿主細胞的粘附而阻止了合胞體的形成而發揮作用;2)抑制HIV-1抗原的表達;3)增強免疫系統的功能。

2.3 抗氧化

超氧陰離子自由基、羥基自由基等自由基對身體損害并且與心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等密切相關，合成有效的抗氧化劑對這些自由基進行有效的清除成為現在的研究熱點。過渡金屬鐵、銅是許多自由基產生過程的催化劑。若是把這些離子螯合了，使其無法催化自由基的生成，從而達到減少自由基的作用。硫酸化多糖都可以對金屬離子有螯合作用，如硫酸化殼聚糖等。研究發現硫酸化多糖、蛋白的抗氧化活性大小直接或間接地與其分子結構，硫酸根基團的多少有密切的關系。例如:Xing等［12］合成的硫酸化殼聚糖對各種自由基的清除能力都很好。張澤慶等［25］合成的硫酸酯化防風多糖對羥基自由基和超氧自由基有較好的清除能力。

2.4 增強免疫作用

生物大分子經過硫酸化修飾后，增加了其免疫功能。楊鐵虹等研究結果表明，當歸多糖的硫酸酯對脾細胞增殖有促進作用，且與劑量有相關性［26］。盧宇等［27］用氯磺酸-吡啶法制備了硫酸化淫羊藿多糖，發現修飾后的淫羊藿多糖提高了淋巴細胞的增殖，而促進淋巴細胞分泌抗病毒干擾素和白介素等細胞因子是生物活性多糖抗病毒和增強免疫的機制之一。王魯等［28］制備了硫酸化人參總皂苷，結果表明，人參總皂苷對于淋巴細胞的增殖影響不明顯，而硫酸化修飾后的人參總皂苷在較低的濃度下就能明顯的增加淋巴細胞(雞的外圍淋巴細胞、小鼠脾淋巴細胞)的增殖。郭克曉等［29］從灰樹花中提取多糖并對多糖進行硫酸化修飾，結果表明，在10 mg/kg劑量下，灰樹花多糖及硫酸化灰樹花多糖都具有免疫增強作用，但是在合適的取代度下硫酸化灰樹花多糖比灰樹花多糖表現出更強的免疫調節作用。

2.5 抗腫瘤

據先宏等的報道［30］，海藻硫酸多糖可以通過對巨噬細胞的調節使腫瘤細胞凋亡，這為研究具有抗腫瘤活性的硫酸化多糖提供了理論依據。隨后，Wang等［31］的研究發現，硫酸化脫脂米糠多糖具有抗腫瘤活性，而且硫取代度越高，其抗腫瘤活性也越強。徐中平［32］等的研究結果也表明，用磺化試劑制得的硫酸化昆布多糖具有抑制血管新生和抗腫瘤的作用。

3 影響硫酸化生物大分子生物活性的因素

3.1 硫酸基團

硫酸根的引入使得生物大分子的理化性質發生改變，從而影響其生物活性。在未引入硫酸基團的時候，有些多糖并沒有抗氧化性，抗凝血等生物活性，引入硫酸根后，多糖、蛋白被賦予了抗氧化、抗凝血等生物活性。卡拉膠和肝素等具有抑制皰疹病毒復制、抗凝血的活性，但是如果將這些多糖的硫酸根除去，上述活性則隨之消失，說明硫酸基團的引入對于多糖、蛋白的生物活性的改善具有關鍵的作用［33］。絲素蛋白中含有許多由6種氨基酸殘基交替排列的結構(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-)，其中絲氨酸(Ser)之間的距離，與肝磷脂中有抗凝血作用的重要基團硫酸基團的距離十分相近，故若能在Ser中引入硫酸基，也能制造出類似肝磷酯的結構，則可賦予絲素抗凝血活性［34，35］。Tamada用濃硫酸法［3］，和氯磺酸-吡啶法［5］分別制得了硫酸化絲素蛋白，前種方法制備的硫酸化絲素蛋白的硫酸根含量為0.3 mmol/g，當硫酸化絲素蛋白的濃度大于20 mg/mL可以使凝血時間延長至60 min以上。后種方法制備的硫酸化絲素蛋白的硫酸根含量為1.0 mmol/g，此時當硫酸化絲素蛋白只需0.5 mg/mL的量就能使凝血時間延長至60 min以上。Wang等［31］制備了9種硫酸化脫脂米糠多糖，發現硫取代度越大的多糖，其抗腫瘤活性越強。所以增加硫酸化效率對于改善多糖、蛋白的生物活性具有極其重要的作用。另外，硫酸根取代度，即每二糖單位中的硫酸根數量，是對多糖生物活性影響的重要因素之一。研究表明，多糖硫酸酯的生活活性與其取代度在一定范圍內呈正相關［36］，一般認為硫酸根取代度為0.81～1.29時，多糖的生物活性比較好［31］。

3.2 分子量大小及結構的影響

生物大分子的硫酸酯化的性質不僅與硫酸根的含量有關，還與分子量、結構有一定關系。Yamada等［37］制備得到硫酸化卡拉膠，研究發現低分子硫酸化卡拉膠(分子量50，000 Da)比其他分子量的硫酸化卡拉膠的抗HIV的活性高。Xing等［12］合成的低分子硫酸化殼聚糖比高分子硫酸化殼聚糖對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力要強。說明在硫酸化修飾后，硫酸化產物的生物活性與分子量的大小密切相關。此外硫酸根是帶有負電荷的基團，引入硫酸根后，生物大分子的構象因為硫酸根的靜電斥力而發生改變，使多糖、蛋白的分子極性增加，改變了多糖、蛋白的結構，增加了其溶解度，從而影響生物大分子的生物活性。另外，多糖自身的結構也對多糖的生物活性有著重要的影響。例如多糖的糖單元組成、糖苷鍵類型直接決定多糖的活性，支鏈的類型、聚合度、在多糖鏈上的分布及其取代度決定了多糖活性的強弱。多糖分子的高級結構如鏈的柔韌性和空間構像比一級結構對多糖活性的影響更大［2］。一般雜多糖硫酸酯化產物的生物活性小于勻多糖硫酸酯化產物的活性。例如，硫酸化雜多糖對抗III型人類T淋巴細胞病毒比硫酸化勻多糖的活性要弱。Yang等［38］研究發現，當硫酸根取代多糖的2位羥基時，對抗凝血活性的提高很慢。進一步的研究表明，若硫酸根取代多糖的6位羥基時，對抗凝血活性起很重要的作用。

4 展望

對多糖、蛋白硫酸化改性后，其抗氧化，抗病毒、抗凝血等生物活性可得到改善。在各種硫酸化方法中，傳統的氯磺酸-吡啶法，反應劇烈較難控制，能夠得到硫酸化程度較高的硫酸化產物。超聲，微波輔助合成雖然節約能源，但是硫酸化程度不高。干燥加熱法硫酸化程度較高，且條件溫和，可控，是有效且有前景的方法。目前，開發對于硫酸化多糖，蛋白的藥物應用到臨床的并不是很多，其中的一些硫酸化多糖、蛋白的生物活性很好，相信在不久的將來，以硫酸化多糖、蛋白開發出的新藥可以應用到生物醫藥中。

1 Vark A，et al.Essential of glycobiology.Cold of Glycobiology Laboratory Press，1999.

2 Liu ZF(劉占峰)，Sun HW(孫漢文).Progress of the research on chemically modifications of polysaccharide.J Hebei Univ(河北大學學報)，2005，25:104-108.

3 Tamada Y.Sulfation of silk fibroin by sulfuric acid and anticoagulant activity.J Appl Polym Sci，2003，87:2377-2382.

4 Henry CR，et al.Action of sulfating agents on proteins and model substances.I.Concentrated sulfuric acid.J Am Chem Soc，1946，68:1024-1031.

5 Tamada Y.Sulfation of silk fibroin by chlorosulfonic acid and the anticoagulant activity.Biomaterials，2004，25:377-383.

6 Yang XM(楊曦明)，et al.Study on anti-coagulation activity of polyporus albicans teng sulfate.Chin J Lab Diag(中國實驗診斷學)，2010，14:1031-1034.

7 Gen Y(耿越)，et al.Comparative study on bio-activity of polysaccharide from pinus massoniana pollen and its sulfated derivative.Chin J Biochem Pharm(中國生化藥物雜志)，2010，31:98-102.

8 Huang RH，et al.Influence of functional groups on the in vitro anticoagulant activity of chitosan sulfate.Carbohydr Res，2003，338:483-489.

9 Bae IY，et al.Effect of sulfation on the physicochemical and biological properties of citrus pectins.Food Hydrocolloid，2009，23:1980-1983.

10 Liu Y，et al.Sulfation of a polysaccharide obtained from Phellinus ribis and potential biological activities of the sulfated derivatives.Carbohydr Polym，2009，77:370-375.

11 Wong SS，et al.Novel sulfation of curdlan assisted by ultrasonication.Int J Biol Macromol，2010，46:385-388.

12 Xing R，et al.Preparation of low-molecular-weight and highsulfate-content chitosans under microwave radiation and their potential antioxidant activity in vitro.Carbohydr Res，2004，339:2515-2519.

13 Feng YL，et al.Rapid and efficient microwave-assisted sulfate modification of lentinan and its antioxidant and antiproliferative activities in vitro.Carbohydr Polym，2010，82:605-612.

14 Li CP(李燦鵬)，et al.一種硫酸化絲素蛋白的新制備方法.中國專利，申請號:200910218244.6.

15 Li CP(李燦鵬)，et al.一種硫酸化殼聚糖的新制備方法.中國專利，申請號:201010133255.7.

16 Muzzarellir AA，et al.Chitin in Nature and Technology，1st Ed.New York:Plenum press，1986.469.

17 Vongchan P，et al.Anticoagulantactivity of a sulfated chitosan.Carbohydr Res，2002，337:1239-1242.

18 Baba M，et al.Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses，including herpes simplex virus，cytomegalovirus，vesicular stomatitis virus，and human immunodeficiency virus.Antimicrob Agents Chemother，1988，32:1742-1745.

19 Lu Y，et al.Sulfated modification of epimedium polysaccharide and effects of the modifiers on cellular infectivity of IBDV.Carbohydr Polym，2008，71:180-186.

20 Uryu T，et al.Sulfated alkyl oligosaccharides with potent inhibitory effects on human immunodeficiency virus infection.Biochem Pharmacol，1992，43:2385-2392.

21 Stone AL，et al.Structure-function relations of heparin-mimetic sulfated xylan oligosaccharides:inhibition of human immunodeficiency virus-1 infectivity in vitro.Glycoconj J，1998，15:697-712.

22 Bagasra O，et al.Anti-human immunodeficiency virus type 1 activity of sulfated monosaccharides:comparison with sulfated polysaccharides and other polyions.J Infect Dis，1991，164: 1082-1090.

23 Lopalco L，et al.Anti-HIV type 1 properties of chemically modified heparins with diminished anticoagulant activity.AIDS Res Hum Retroviruses，1994，10:787-793.

24 Xu WQ(徐文清).New advances in studies of sulfated polysaccharide derivatives.Tianjin Pharm(天津藥學)，2002，14:1-4.

25 Zhang ZQ(張澤慶)，et al.硫酸酯化防風多糖的制備及其抗氧化作用研究.中草藥，2009，40:1208-1211.

26 Yang TH(楊鐵虹)，et al.Synthesis of angelica S inensis polysaccharide sulfate and their effects on splenocyte proliferation in vitro.J Fourth Mil Med Univ(第四軍醫大學學報)，2001，22:432-435.

27 Lu Y(盧宇)，et al.Effects of sulfated epimedium polysaccharides on mRNA expression of interleukin-2 and interferon-γin chicken peripheral lymphocyte.Jiangsu J Agr Sci(江蘇農業學報)，2009，25:1073-1077.

28 Wang L(王魯)，et al.Regulating effect of sulfated total saponin of panax ginseng on function of immune competent cell: An in vitro experiment.Chin J Vet Sci(中國獸醫學報)，2009，29:199-202.

29 Guo KX(郭克曉)，et al.Extraction，sulfation and immunological test of maitake D-fraction.J Chin Biotechnol(中國生物工程雜志)，2003，23:65-69.

30 Xian H(先宏)，et al.Regulation of SPS on apoptosis of tumor cells caused by Macrophages.Chin J Cell Mol Immunol(細胞與分子免疫學雜志)，2002，18:288-291.

31 Wang L，et al.Sulfated modification of the polysaccharides obtained from defatted rice bran and their antitumor activities.Int J Biol Macromol，2009，44:211-214.

32 Xu ZP(徐中平)，et al.昆布多糖硫酸酯的抑制血管生成和抗腫瘤作用.中草藥，1999，30:551-553.

33 Huang XY(黃小燕)，et al.Research progress on sulfating modification of polysaccharides and sulfated polysaccharides.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2007，19:328-332，355.

34玉田靖.Sanshi no Hikari，蠶源抗血液凝固物的開発，蠶絲之光，1997，50(4):24-29.

35 Kong XD(孔祥東)，Zhu LJ(朱良均).Research and utilization of fibroin protein on biomaterials.Funct Mater(功能材料)，2001，32:583-585.

36 Wang CY(王長云)，Guang HS(管華詩).Advances in studies of antiviral activity of polysaccharideⅡ.antiviral activity of sulfated polysaccharide.Adv Bio Proj(生物工程進展)，2000，(2):3-8.

37 Yamada T，et al.Preparation and anti-HIV activity of low-molecular-weight carrageenans and their sulfated derivatives.Carbohydr Polym，1997，32:51-55.

38 Yang JH，et al.The structure anticoagulant activity relationships of sulfated lacquer polysaccharide:Effect of carboxyl group and podition of sulfation.Int J Biol Macromol，2005，36:9-15.

Modification of Biomacromolecule by Sulfation and its Biological Activities:A review

CHENG Wei-hua1，FU Guo-ping2，ZHAO Gai-hong1，SHA Meng1，LI Can-peng1*1School of Chemical Science and Technology，Yunnan University，Kunming 650091，PR China;2The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Kunming 650101，PR China

Activities of antivirus，antitumor，anticoagulation and strengthening the immunity from diseases of biomacromolecules could be given by sulfation.In this article，the sulfation methods and biological activies of biomacromolecules were reviewed.

Biomacromolecule;sulfation;anticoagulation;antivirus，antitumor

1001-6880(2012)10-1486-05

2011-01-07 接受日期:2011-03-16

云南省教育廳科學研究基金重大專項項目(ZD2009002);云南省中青年學術與技術帶頭人后備人選項目;國家自然科學基金項目(31160334)

*通訊作者 E-mail:lcppp1974@sina.com

R284.2

A