蜜蜂中腸一株耐氯霉素細菌的篩選與鑒定

陳大福 陳梅強 李江紅 梁 勤

（福建農林大學蜂學學院，福州 350002）

蜜蜂的腸道內棲息著相當數量的微生物類群。這些微生物對于蜜蜂的營養和代謝起著重要的作用。根據微生物與蜜蜂的關系可將其大致分為兩類：病原微生物和共生菌。蜜蜂腸道內存在一定量的病原微生物，其中細菌性病原菌主要包括擬幼蟲芽孢桿菌、蜂房球菌、尤瑞狄斯桿菌、糞鏈球菌、蜂房芽孢桿菌、敗血病桿菌、塵埃芽孢桿菌等。其中對于引起美洲幼蟲腐臭病的擬幼蟲芽孢桿菌和引起歐洲幼蟲腐臭病的蜂房球菌的研究報道最多。2006年，戎映君等分離了一種新的蜜蜂細菌性幼蟲病病原菌，經分離鑒定此致病菌為腸球菌屬的屎腸球菌[1]。蜜蜂與微生物的共生是一種普遍存在的現象，許多共生菌對蜜蜂的生長、發育起著重要作用。蜜蜂與其他昆蟲抵御疾病可能是通過與其共生的微生物的屏蔽效應。Evans & Armstrong的研究表明，某些共生菌對蜜蜂主要病原細菌擬幼蟲芽孢桿菌具有抑制效應，并且共生菌可能對普遍的病原體有自然的拮抗作用[2]。

細菌的16S rRNA因其編碼基因集“保守、變異”于一身，作為生物系統指標最為合適[3]。不同種細菌基因序列的比較研究表明，16S rRNA基因在同種細菌間高度保守，因此，在細菌“種”水平的鑒定上，16S rRNA基因的全序列分析可作為“金標準”[4，5]。16S rRNA基因保守性又是相對的，在保守區間存在著9或10個變異區，不同細菌屬、種間有不同程度的差異。因此，可利用保守區序列設計細菌通用引物將細菌16S rRNA片斷擴增出來，利用可變區序列的差異來對不同菌屬、菌種的細菌進行分類鑒定[6]。

本研究通過用含氯霉素的LB培養基篩選和分離蜜蜂中腸中的細菌，并運用PCR的方法體外擴增并克隆該細菌的16S核糖體RNA基因的片段序列，通過比對序列對細菌進行分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）采自福建農林大學蜂學學院教學蜂場；菌株是從意大利蜜蜂成年工蜂中腸中篩選分離培養所得。

1.2 方法

1.2.1 蜜蜂中腸細菌的篩選分離

制作若干含終濃度為20 μg/mL氯霉素的LB培養基，取成年蜜蜂中腸的內容物，搗碎加適當的滅菌水稀釋攪勻，均勻涂布在培養基上，挑取菌斑，提取細菌基因組DNA。

1.2.2 細菌的裂解

用滅菌移液槍的槍頭挑取單個菌斑，加入到含有200 μl細菌裂解液和1 μl蛋白酶K的離心管中，用震蕩器將之混勻，置PCR儀中裂解反應。反應程序：65 ℃溫育30 min，98 ℃裂解20 min，裂解反應結束后12000 rpm離心5 min取上清液6μl做PCR反應模板。

1.2.3 引物的設計與合成

在GenBank中檢索出多種細菌的16 S rRNA基因序列，通過Blast軟件在線進行同源性比較，在16S rRNA基因序列的保守序列區間設計通用引物。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2.4 細菌16s rRNA基因片段的克隆

1.2.4.1 聚合酶鏈式反應（PCR）

（1）反應體系：模板DNA（細菌裂解液）6 μl，10×PCR緩沖液5 μl，dNTPs 4 μl，引物F、R各2 μl，Taq酶2μl，補ddH2O至50 μl。

（2）反應程序：98 ℃預變性3 min，95 ℃ 變性45 s、52 ℃退火合成105 s、72 ℃延伸30 s，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min，8 ℃保存。

1.2.4.216s rRNA基因片段的克隆與測序

本研究采用低熔點瓊脂糖凝膠法，用DNA快速純化回收試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品）純化回收PCR產物。利用pGEM-T Easy Vector SystemⅠ試劑盒（Promega）進行載體連接與轉化，用質粒快速提取試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品）提取質粒DNA，經限制性內切酶EcoRⅠ進行酶切鑒定。一般反應體系為：EcoRⅠ1 μl，10×Buffer 2 μl，質粒DNA 3 μl（≤1 μg），滅菌水補至20 μl。37℃溫浴反應2～3 h。反應產物經瓊脂糖凝膠電泳后，能切出相應片段的即為陽性。將鑒定為陽性克隆的菌液，委托生工生物工程有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 引物的設計與合成

利用Primer-BLAST軟件在線與細菌的16S rRNA基因片段序列進行多重比對分析各序列的保守區和變異區，設計并合成細菌16S rRNA基因片段序列的通用引物：

F：5'- GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'R：5'- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'

2.2 細菌16s rRNA基因片段序列的克隆

2.2.1 PCR擴增與產物回收

用設計的通用引物分別對DNA樣品進行PCR擴增，使用DNA快速純化/回收試劑盒回收PCR產物，溶解于20μl的TE溶液中。取5μl回收的產物經1.5 %（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳，可見到1500bp左右的單一條帶非常清晰，說明回收得率較高（圖1）。

2.2.2 重組質粒的酶切鑒定

將重組質粒DNA和原空載體質粒DNA分別用限制性內切酶EcoRⅠ進行酶切反應。反應產物經瓊脂糖凝膠電泳。空載體質粒DNA經酶切后，僅產生2000bp以上的單一條帶。而重組質粒DNA酶切產物中產生大小為750bp左右2個片段，該2個片段大小之和與1500bp左右的PCR產物基本相等（圖2），酶切產生2個片段可能是PCR產物片段內部還有一個EcoRⅠ位點。因此，該重組質粒即可鑒定為陽性克隆。

圖1 細菌DNA的PCR產物純化回收凝膠電泳圖譜

2.3 16S rRNA基因片段的序列分析

將鑒定為陽性的克隆C3委托上海生工生物工程公司進行測序。測序結果表明所克隆的16S rRNA基因片段為1506 bp的DNA片斷（圖3）。使用RESEARCH軟件查找結果如預計一樣在第666位有一個EcoRI酶切位點，經EcoRI酶切為665bp和835bp的2個片段。

圖2 重組質粒酶切鑒定

圖3 細菌16S rRNA基因片段序列

2.4 耐氯霉素細菌菌株的鑒定

將所測得序列與NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank收錄細菌16S rRNA基因序列進行比對。結果可以搜索到大量細菌的16S rRNA基因片段序列與所測得細菌的序列有較高的相似度（圖4）。該序列與GQ259887序列吻合度100 %，證明該序列為克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）的特有序列，說明從蜜蜂中腸中培養分離出的耐氯霉素細菌菌株為克雷伯氏菌。

圖4 所測細菌的16S rRNA基因片段序列與數據庫比對結果

4 討論

（1）細菌16S rRNA鑒定方法作為分子生物學快速發展的產物，與傳統的診斷方法相比，準確性和靈敏度均有了較大的提高。由于l6S rRNA序列的保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的穩定性，序列分析的重現性極高，基于當今分析技術的改進，應用16S rRNA作為分子指標，可以實現快速、微量、準確簡便的對微生物進行分類鑒定。

（2）本研究從蜜蜂中腸分離出的耐氯霉素菌株經鑒定為克雷伯氏菌。克雷伯氏菌為腸桿菌科中一類有莢膜的革蘭氏陰性桿菌，對外界抵抗力強對多數抗生素易產生耐藥性。與腸桿菌科其他細菌一樣，具菌體抗原和莢膜抗原。克雷伯氏菌廣泛存在于人和動物腸道、呼吸道以及水、土壤和谷物中[7]。Singh等[8]于1992年在魚、蝦、蟹等水產類食品中檢測到肺炎克雷伯菌，但未對其致病性展開研究。還有一些學者先后在患病石龜、中華鱉（Trionyx sinensis）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）中分離到該菌[9，10]；在蜜蜂體內尚屬首次發現該菌。一般情況下克雷伯氏菌不致病，因為它是一種條件致病菌，對畜禽危害不大，發病與寄主防御功能缺陷及誘發因素有關。目前尚未發現有克雷伯氏菌引起的蜜蜂疾病，但不排除有和其他細菌共同作用引起蜜蜂疾病的可能性。

（3）本研究結果證明在蜜蜂腸道中存在某些耐藥性的菌株。這一現象很可能是在養蜂生產過程中給蜂群防病、治病而長期、頻繁使用抗生素造成的。蜂群用藥過程中所使用的抗生素對蜜蜂腸道細菌，無論是共生菌還是病原菌均產生影響，長此以往，蜜蜂腸道細菌都會對所使用的抗生素產生一定程度的耐藥性。因此，在蜂群中不科學使用抗生素，不僅會使蜜蜂病原菌產生耐藥性，影響防治效果，還會對蜂產品質量產生嚴重影響。這就要求在養蜂生產過程中謹慎用藥，避免大劑量使用，長期使用，以延緩病原菌耐藥性的產生。

[1]戎映君, 蘇松坤等.一種新的蜜蜂細菌性幼蟲病病原菌的分離鑒定.微生物學報, 2006, 46(6): 994-998.

[2]Evans JD, Armstrong TN.Antagonistic interactions between honey bee bacterial symbionts and implications for disease.BMC Ecol,2006, 6: 4.

[3]Perea EJ.Orat flora in the age of molecular biology.Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2004, 9(Supp1): 6-10.

[4]Woo PC, Ng KH, Lau SK, et a1.Usefulness of the MicroSeq 50016S ribosomal DNA-based bacterial identification system for identification of clinically significant bacterial isolates with ambiguous biochemical profiles.J Clin Microbial, 2003, 41(5): 1996-2001.

[5]Lau SK, Woo PC, Woo GK, et al.Catheter-related mycobacterium identified by 16S rRNA gene sequencing.J Clin Microbiol, 2002,40(7): 2681-2685.

[6]姜靜, 楊圣輝, 王松靈.16S rRNA基因及16S-23S rRNA基因間隔區在口腔微生物鑒定中的應用.口腔醫學, 2006, 14(4): 297-299.

[7]黃印堯, 萬沅, 陳信忠, 等.雞源肺炎克雷伯氏菌的致病性和生物學特性研究.福建畜牧獸醫, 1996, 18(2): 4-5.

[8]Singh BR, Kulshreshtha SB.Preliminary examinations on the enterotoxigenicity of isolates of Klebsiella pneumoniae from sea foods.Int J Food Microbiol, 1992, 16(4): 349-352.

[9]陶錦華, 李康然, 韋平.石龜肺炎克雷伯氏菌感染的診斷與防治.廣西畜牧獸醫, 2002, 18(6): 20.

[10]徐海圣, 舒妙安.中華鱉肺炎克雷伯氏菌病的病原研究.浙江大學學報, 2002, 29(6): 702-706.