蜂糧源乳酸菌發(fā)酵油菜蜂花粉的工藝優(yōu)化

楊文超 劉 賽 吳珍紅 繆曉青

（福建農(nóng)林大學蜂學學院, 蜂產(chǎn)品加工與應用教育部工程研究中心，福州 350002）

蜂糧也稱蜂巢花粉、蜂面包，是雄蜂和工蜂的主要食料和營養(yǎng)來源，蜂糧是一個復雜的微生物系統(tǒng)，具有寶貴的微生物資源[1，2]。優(yōu)良菌株是發(fā)酵制品得到良好的風味、質(zhì)地以及產(chǎn)品穩(wěn)定性的基礎，是保證產(chǎn)品標準化的關鍵[3]。乳酸菌不僅可以改善食品風味，提高食品保藏性和附加值，還有很多特殊的醫(yī)療保健功能[4-7]。從蜂糧中篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵性能的乳酸菌菌株應用在蜂花粉的發(fā)酵中，對油菜蜂花粉的深加工開發(fā)具有指導意義。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

MRS液體培養(yǎng)基（1000ml）：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4·7H2O 2.0g，醋酸鈉·3H2O 5.0g，檸檬酸三銨 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐溫801.0ml，pH6.2，115 ℃滅菌15～20 min；MRS培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：5°Bé麥芽汁100ml，瓊脂1.5g，pH=7.0；紅曲霉種子培養(yǎng)基（100ml）：5g玉米粉加適量水，于60℃水浴4 h后用8 層紗布過濾，去除殘渣得到玉米漿，加入0.2gNaNO3，0.5g KH2PO4，0.1g MgSO4·7H2O，補足蒸餾水；pH自然，121℃滅菌30min；紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10%，NaNO30.5%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH自然；配置方法詳見紅曲霉種子液。

蜂糧源乳酸菌的選定：經(jīng)過分離、純化、初篩、復篩，從蜂糧樣品中得到3株乳酸菌。根據(jù)API 50 CH鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果，3株菌分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌干酪亞種（Lactobacillus casei ssp casei）、德式乳桿菌德氏亞種（Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii）。分別接種到油菜蜂花粉中進行單菌發(fā)酵，測定菌體生長情況和產(chǎn)酸情況，確定植物乳桿菌最適宜應用于蜂花粉發(fā)酵。

油菜蜂花粉：由福建省神蜂科技開發(fā)有限公司提供；煙色紅曲霉：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；胃蛋白酶：天津市諾奧科技發(fā)展有限公司。

電熱恒溫生化培養(yǎng)箱 SPX-250B-Z（上海博迅實業(yè)有限公司），電熱恒溫水浴鍋 DK-98-1（天津泰斯特儀器制造有限公司），人工凈化操作臺 SWCJ -1D（蘇州凈化設備有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器 YXQ-LS-75SП（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），恒溫搖床 HZ250L（武漢瑞華儀器設備有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

乳酸菌：從MRS斜面上挑取2～3環(huán)菌株，接入裝有10ml MRS液體培養(yǎng)基的試管中，36℃靜止培養(yǎng)12h，再以10%接入量接入裝有100ml MRS液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，36℃增菌培養(yǎng)12h。

紅曲霉：用無菌水洗下麥芽汁斜面培養(yǎng)基菌種，并刮下表面菌絲，接種到裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)2d。

1.2.2 紅曲霉發(fā)酵液制備

將培養(yǎng)好的種子液以10%接種量接入到裝有100ml發(fā)酵液培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)7d。

1.2.3 接種方式確定

（1）植物乳桿菌單菌發(fā)酵；（2）將乳酸菌與紅曲霉種子液同時接入到蜂花粉中發(fā)酵；（3）先將紅曲霉種子液接種到紅曲霉發(fā)酵液中搖瓶培養(yǎng)，將乳酸菌種子液接入到蜂花粉中，同時添加制備好的紅曲霉發(fā)酵液。以乳酸菌活菌數(shù)和蜂花粉pH值為參考指標，比較發(fā)酵效果。

1.2.4 蜂花粉發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定乳酸菌接種量（%）、紅曲霉發(fā)酵液添加量（%）、加水量（%）、發(fā)酵溫度（℃）設計L9（34）正交試驗，以乳酸菌活菌數(shù)和感官評分為指標對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。

1.2.5 蜂花粉乳酸菌計數(shù)

稱取5.0g發(fā)酵后的蜂花粉，十倍稀釋法制得適宜稀釋度的樣品稀釋液。選擇2～3個適宜稀釋度，分別吸取1 ml，傾注法接種到MRS培養(yǎng)基，36 ℃厭氧培養(yǎng)48h（每個稀釋度做兩個平板）。選取菌落總數(shù)在30CFU-300CFU之間的平板計數(shù)，取平均值[8]。

1.2.6 感官評定

參考“0-4評判法”[9]，請10名從事食品研究的工作者對各因素兩兩進行重要性比較，確定發(fā)酵蜂花粉感官評價時各因素的權(quán)重：A=[0.34，0.27，0.39]

以發(fā)酵蜂花粉的顏色、香氣和滋味三個因素為主要評價指標，每個指標滿分為5分。請10名食品感官質(zhì)量考評員進行感官質(zhì)量評價，評分標準見表1。

1.2.7 驗證試驗

表1 發(fā)酵蜂花粉感官評分標準

用正交試驗確定的最佳條件進行蜂花粉發(fā)酵，測定所的結(jié)果，比較其與試驗組的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種方式的確定

從表2中可知，同時發(fā)酵時，乳酸菌活菌數(shù)隨著發(fā)酵時間的延長而下降，分析原因可能是紅曲霉生長周期較長，其生長消耗蜂花粉中營養(yǎng)物質(zhì)，乳酸菌不能進一步獲取足夠的營養(yǎng)物質(zhì)而死亡；也有關于紅曲霉與乳酸菌之間存在相互抑制作用的報道[10]。同時，從表2中可以看出，添加紅曲霉發(fā)酵液對乳酸菌的生長有一定的促進作用，原因可能是紅曲霉發(fā)酵液的中含有蛋白酶、糖化酶等，能夠分解蜂花粉中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)，從而為乳酸菌生長代謝提供能量來源。綜合比較可知，最佳接種方式為先將紅曲霉種子液接種到紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)，將制備好的紅曲霉發(fā)酵液添加到蜂花粉中，接種乳酸菌種子液進行發(fā)酵。

2.2 乳酸菌接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響

表2 不同接種方式的乳酸菌活菌數(shù)和蜂花粉pH值

表3 乳酸菌接種量對產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官特征的影響

當乳酸菌接種量小于10%時，乳酸菌體數(shù)量較少，蜂花粉發(fā)酵不明顯，香氣和滋味都不理想，乳酸菌活菌數(shù)也較少；接種量達到10%時，蜂花粉發(fā)酵較充分，乳酸菌活菌數(shù)也較高，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，確定乳酸菌接種量的最佳值為10%。

2.3 紅曲霉發(fā)酵液添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響

添加量為5%時，蜂花粉中乳酸菌活菌數(shù)低，感官也較差，這可能是因為酶類物質(zhì)不足，乳酸菌發(fā)酵受到限制。當添加量大于15%時，乳酸菌活菌數(shù)較高，但產(chǎn)品感官較差，原因可能有：1）紅曲霉發(fā)酵液顏色較深，添加量過多會影響產(chǎn)品色澤；3）紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生醬香氣；2）乳酸菌在酶類物質(zhì)的幫助下，在蜂花粉中的存活時間延長，從而產(chǎn)酸多，使產(chǎn)品過酸。綜合以上原因，選擇10%為紅曲霉發(fā)酵液最佳添加量。

2.4 加水量對發(fā)酵結(jié)果的影響

由表5可知，隨著加水量的增加，蜂花粉中乳酸菌活菌數(shù)增加，但加水量大于20%后，蜂花粉香氣較弱。當加水量為20%時，乳酸菌活菌數(shù)高，感官特性也好，故選擇最佳加水量為20%。

表4 紅曲霉發(fā)酵液對產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官特征的影響

表5 加水量對產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官特征的影響

2.5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響

在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，乳酸菌活菌數(shù)增加，36℃時達到最高峰。從感官角度考慮，溫度過低時發(fā)酵不充分，蜂花粉還帶有苦味，而過高時產(chǎn)品顏色較深，滋味也不佳。當發(fā)酵溫度為33℃時乳酸菌活菌數(shù)較高，感官特性好，因此選其為發(fā)酵最佳溫度。

2.6 發(fā)酵工藝條件正交試驗

正交試驗結(jié)果見表7。

從表中的極差分析可以看出，對乳酸菌活菌數(shù)的影響由大到小的順序為乳酸菌活菌數(shù)＞紅曲霉發(fā)酵液添加量＞加水量＞發(fā)酵溫度最優(yōu)水平為A3B3C3D2。而影響產(chǎn)品感官分數(shù)的因素主次順序為乳酸菌活菌數(shù)＞紅曲霉發(fā)酵液接種量＞發(fā)酵溫度＞加水量，因素最優(yōu)水平為A3B2C1D2。可見對于乳酸菌活菌數(shù)和感官分數(shù)而言，4個因素的影響程度不一致，最優(yōu)方案也不同。為了進一步比較各因素水平的優(yōu)先順序，分別以活菌數(shù)、感官分數(shù)極差值的平均值Ki為縱坐標，以各因素水平為橫坐標做圖（圖1和圖2）。

表6 發(fā)酵溫度對產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官特征的影響

表7 L9(3)4正交試驗結(jié)果

圖1 乳酸菌活菌數(shù)隨各因素水平的變化趨勢

圖2 感官分數(shù)隨各因素水平的變化趨勢

結(jié)合圖5和6和極差分析，因素A對于兩個指標都是取A3好；因素B是兩個指標中較重要的因素，對于乳酸菌活菌數(shù)而言，取B3（13%）最好，但取B3時感官分數(shù)低。因此感官特征優(yōu)先考慮選擇B2。因素C從乳酸菌活菌數(shù)角度出發(fā)，應取C3（15%），但對感官分數(shù)而言取C1好。由于因素C3對乳酸菌活菌數(shù)的影響大于對感官的影響，因此選擇C3。因素D對于兩個指標都是取D2好。綜合各個因素，發(fā)酵工藝的最佳組合為A3B2C3D2，即乳酸菌接種量13%，紅曲霉添加量10%，加水量25%，發(fā)酵溫度33℃。

2.7 驗證試驗

乳酸菌接種量13%，紅曲霉添加量10%，加水量25%，發(fā)酵溫度33℃ 進行油菜蜂花粉的發(fā)酵，產(chǎn)品的乳酸菌活菌數(shù)為2.2×107cfu/g，感官評分4.24，優(yōu)于其他實驗組。

3 結(jié)論

采用從蜂糧中分離得到的植物乳桿菌可以對蜂花粉進行發(fā)酵。通過以乳酸菌活菌數(shù)和感官評分為試驗指標，在單因素基礎上對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，正交試驗得到發(fā)酵工藝的最佳組合為乳酸菌接種量13%，紅曲霉發(fā)酵液添加量10%，加水量25%，發(fā)酵溫度33℃。發(fā)酵后的蜂花粉酸甜適口，且富含益生菌。

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