脂多糖與干擾素α聯(lián)用誘導(dǎo)白血病U937細胞凋亡及其機制*

邱元秀 王曉桃 莫東華

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLRs）是存在于哺乳動物細胞表面的一種跨膜蛋白受體，表達于各種腫瘤細胞，在多種血液系統(tǒng)腫瘤細胞中也有表達[1]。內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是Toll樣受體的主要外源性配體，LPS須與其受體結(jié)合后才能通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生效應(yīng)。Lehner等[2]研究表明TLRs的主要外源性配體LPS和干擾素（IFN）-α共同作用于急性單核細胞白血病細胞株THP-1時，有協(xié)同促進細胞凋亡的作用，并檢測到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-8的活性及Fas/CD95的表達明顯增高。本研究探討LPS與IFN-α聯(lián)用對白血病U937細胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用及其對caspase-8的調(diào)節(jié)作用，為尋找和開發(fā)TLR激動劑或TLR配體臨床免疫治療白血病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI-1640干粉、Trizol試劑（美國Gibco公司）、胎牛血清（杭州四季青）、噻唑藍（MTT，美國Sigma公司）、DMSO（杭州雙林）、逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（大連寶生物工程有限公司）、各引物序列均由上海博亞公司設(shè)計和合成，F(xiàn)luor ChemTM8900凝膠成像系統(tǒng)分析儀器（美國Alpha Innotech公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) 人AML細胞系U937由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈傳代引進后，常規(guī)離心棄上清液，復(fù)蘇后的細胞在RPMI1640培養(yǎng)液（含10%的胎牛血清，青霉素、鏈霉素各1×105U/L），置37℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液。本實驗用的細胞均處于對數(shù)生長期，根據(jù)處理細胞藥物的不同將實驗組分為單用2 000 U/mL IFN-α（IFN-α組）、200 μg/L LPS（LPS組）及 2 000 U/mL IFN-α+200 μg/L LPS處理（聯(lián)合組）；對照組不加任何藥物處理細胞。

1.3 細胞生長抑制率的測定 采用MTT還原法進行檢測。取對數(shù)生長期的U937細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度至5×105/L，將細胞加入96孔平底培養(yǎng)板中，實驗組每組各重復(fù)5個平行孔，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，每孔加入上述細胞懸液100 μL。置于37℃、含5%的CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24、48 h后從培養(yǎng)箱中取出，每孔加入MTT（5 g/L）10 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后取出，2 000 r/min離心10 min后吸去上清液，每孔再加入DMSO 100 μL，充分將培養(yǎng)板震蕩均勻5 min左右使結(jié)晶溶解，選擇490 nm波長用酶標儀測各孔吸光度（A）值。計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率=[對照組A值-實驗組A值]/對照組A值×100%。

1.4 細胞凋亡率的測定 收集各組藥物處理后培養(yǎng)24、48 h細胞，以PBS緩沖液清洗2次后再將細胞沉淀充分混勻，用70%的冷乙醇4℃固定24 h以上。離心去除乙醇固定液，用PBS清洗1次后，加入200 mg/L去DNA酶的RNA酶，然后用流式細胞儀分析不同DNA含量的細胞分布。應(yīng)用ModifitL TL 1.00（MAC）分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)處理，低于G1期的細胞（亞G1期）為凋亡細胞，其占細胞總數(shù)的比例為凋亡細胞比例。

1.5 RT-PCR檢測caspase-8 mRNA的表達 根據(jù)流式結(jié)果選擇凋亡率明顯的48 h進行RT-PCR檢測。收集各組U937細胞，按Trizol法提取各組細胞總RNA，使用分光光度儀檢測RNA的濃度與質(zhì)量，要求A260nm/A280nm在2.0左右進行純化和鑒定。取總RNA約2 μg隨機引物法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體積為20 μL，取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL cDNA按試劑盒說明書提示的步驟進行擴增。引物的設(shè)計與合成是利用Oligo軟件由上海博亞公司完成。caspase-8引物序列：上游5′-CT GCTGGGGATGGCCACTGTG-3′；下游5′-TCGCCTCGAGGAC ATCGCTCTC-3′，擴增片段366 bp。β-actin引物序列：上游5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACT-3′； 下 游5′-GTCACGCACG ATTTCCCGCT-3′，擴增片段150 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，caspase-8、β-actin分別為40、35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。反應(yīng)完畢，取10 μL PCR擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，電泳完畢后在Fluor ChemTM8900凝膠成像系統(tǒng)分析儀器下進行觀察并分析。試驗重復(fù)3次。目的基因mRNA表達量=每例標本目的基因的平均灰度值/同一標本β-actin的平均灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞生長抑制率比較 各實驗組與對照組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01），且聯(lián)合組較IFN-α組、LPS組細胞生長抑制率變化明顯（均P<0.01），見表1。

Table 1 Effects of different drugs on inhibitory rate,apoptotic rate and expression of caspase-8 mRNA of U937 cells表1 不同藥物作用U937細胞的抑制率、凋亡率和caspase-8 mRNA表達

2.2 各組細胞凋亡率比較 各實驗組細胞凋亡率與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01），且聯(lián)合組較IFN-α組、LPS組細胞凋亡率變化明顯（均P<0.01），見表1。

2.3 各組細胞caspase-8 mRNA表達水平比較 RTPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示藥物處理U937細胞后caspase-8 mRNA的表達明顯增多，且IFN-α+LPS組較IFN-α組、LPS組caspase-8 mRNA表達值變化明顯（均P<0.01），見圖1、表1。

Figure 1 The expression of caspase-8 mRNA detected by RT-PCR圖1 RT-PCR檢測caspase-8 mRNA的表達水平

3 討論

隨著免疫研究的進展，免疫治療在血液腫瘤治療中的作用受到重視。最近白血病的免疫治療方案中已包含TLRs激動劑，利用TLRs在腫瘤細胞表達差異的特性作為靶點的免疫治療已逐漸引起關(guān)注[3]。TLRs在絕大多數(shù)血液系統(tǒng)惡性腫瘤中均有不同程度的表達，可表達于B系淋巴瘤細胞、B系慢性淋巴細胞白血病細胞和骨髓瘤細胞，并且發(fā)揮一定生物學(xué)效應(yīng)。不同的TLRs通過識別相應(yīng)不同的病原相關(guān)分子模式，在防御外來微生物入侵的先天性免疫過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，并被視為聯(lián)系固有免疫與獲得性免疫的橋梁。

Huang等[4]研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞上用TLR配體LPS激活TLR4信號途徑可促進多種腫瘤細胞的凋亡。Hammadi等[5]研究發(fā)現(xiàn)當TLR7激動劑作用于B系慢性淋巴細胞白血病細胞后，導(dǎo)致細胞凋亡及生長抑制增強。干擾素具有廣泛的抗腫瘤活性，目前已被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的輔助治療，并且在與其他藥物聯(lián)合使用治療白血病方面也有一定的進展。劉加軍等[6-7]的研究結(jié)果表明IFN-α能抑制單核細胞白血病U937細胞的生長并誘導(dǎo)細胞凋亡，且與阿糖胞苷聯(lián)合應(yīng)用對白血病K562細胞具有明顯的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。本研究結(jié)果顯示IFN-α、脂多糖聯(lián)用作用于U937細胞24、48 h后，細胞生長抑制率和凋亡率較對照組升高，且兩者聯(lián)用較單用IFN-α、脂多糖細胞生長抑制率和凋亡率變化更明顯。Caspase家族是介導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶家族，caspase-8是誘導(dǎo)細胞凋亡信號途徑中的重要啟動因子，主要參與由死亡受體(Fas、DR4和DR5等)介導(dǎo)的外源性細胞凋亡途徑，在死亡受體Fas介導(dǎo)的信號通路中,Fas與其配體偶聯(lián)后招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白并激活T細胞內(nèi)凋亡啟動酶caspase-8分子,活化的caspase-8可通過一系列的級聯(lián)反應(yīng)激活下游的凋亡效應(yīng)蛋白酶分子而促使細胞凋亡[8-9]。Lehner等[2]研究報道IFN-α、LPS聯(lián)用能明顯增強白血病細胞的凋亡，其機制可能是LPS處理白血病細胞后啟動TLRs發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，促發(fā)機體的免疫反應(yīng)，從而增強抗白血病效應(yīng)；也可能是兩者聯(lián)用作用于細胞后激活細胞內(nèi)外多條信號通路，導(dǎo)致caspase-8等活化進一步加強，促進細胞外凋亡途徑加強，從而進一步增強細胞凋亡[10]。在本研究中，藥物作用U937細胞48 h后，caspase-8 mRNA的表達較對照組升高，且兩者聯(lián)用較單用IFN-α、脂多糖變化明顯，這與上述文獻報道一致。

綜上，LPS與IFN-α聯(lián)用對白血病細胞具有明顯的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，其凋亡機制可能與caspase-8的激活有關(guān)，這可能是其抑制白血病細胞生長及誘導(dǎo)細胞凋亡的重要機制之一。

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