重癥甲型H1N1流感病毒肺炎患者多臟器病理研究

茹永新 楊敬平 李月川 賈 瑋 趙 勇 李 睿 徐喜媛 趙軾軒 龐天翔

甲型H1N1流感是變異的甲型H1N1流感病毒引起的以呼吸道癥狀為主要表現(xiàn)的傳染性疾病。該病2009年3月起源于墨西哥和美國(guó)西南部，2009年5月開始在國(guó)內(nèi)蔓延，據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部通報(bào)，截至2009年12月31日境內(nèi)感染近12萬例，死亡648例[1]。盡管普遍認(rèn)為流感病毒引發(fā)的急性肺損傷或呼吸窘迫綜合征和原有心、肺及代謝性疾病的加重是患者病情加重或死亡的主要原因，但多臟器病理活檢在揭示疾病本質(zhì)和死因方面仍有不可替代的作用。本研究在分析12例重癥甲型H1N1流感病毒性肺炎的臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)其中5例死亡患者進(jìn)行多個(gè)臟器的病理學(xué)研究，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組12例患者均于2009年11月—12月發(fā)病，9例在內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院呼吸重癥監(jiān)護(hù)病房（RICU）住院治療，3例在天津市胸科醫(yī)院RICU住院治療。結(jié)合臨床癥狀、影像學(xué)、心電圖、痰菌培養(yǎng)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)結(jié)果，依據(jù)衛(wèi)生部《甲型H1N1流感診療方案（2009年第3版）》，所有患者確診為重癥甲型H1N1流感病毒性肺炎。本組患者均為男性，年齡30～79歲，平均（57.0±16.7）歲，所有患者以發(fā)熱、咳嗽發(fā)病，其中氣短10例，肌痛9例，咯血2例；胸部影像學(xué)提示肺炎、間質(zhì)肺炎12例（其中伴纖維化4例）。心電圖示竇性心動(dòng)過速5例、完全性右束支傳導(dǎo)阻滯2例、心肌缺血表現(xiàn)2例、房顫1例、室內(nèi)傳導(dǎo)阻滯1例、竇性心律1例。痰細(xì)菌培養(yǎng)鮑曼不動(dòng)桿菌、白假絲酵母、鏈球菌、金黃色葡萄球菌各1例，陰性8例。經(jīng)住院治療，7例痊愈出院，5例死亡。

1.2 病理研究方法 5例死亡患者臨床死亡后5 min內(nèi)纖維支氣管鏡下取支氣管黏膜組織，經(jīng)皮穿刺取肺、肝、心和腓腸肌組織。標(biāo)本用3%戊二醛固定，部分標(biāo)本行蘇木素-伊紅和吉姆薩染色，部分按照透射電鏡標(biāo)本制備。電鏡標(biāo)本塊用瑞典LKB超薄切片機(jī)切成50 nm厚度切片，醋酸鈾和硝酸鉛染色，日本東芝H600電鏡觀察[2]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料采用±s或M（P25，P75）表示。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 2例白細(xì)胞（WBC）升高，其余10例在正常范圍。11例動(dòng)脈氧分壓[p（O2）]降低，8例動(dòng)脈二氧化碳分壓[p（CO2）]降低。11例乳酸脫氫酶（LDH）和α-羥丁酸脫氫酶（HBDH）升高，6例肌酸激酶（CK）升高，8例天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）升高，10例C反應(yīng)蛋白（CRP）升高，見表1。

Table 1 Laboratory results of patients表1 患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

2.1 光鏡及電鏡下表現(xiàn) 見圖1～4。

2.2.1 支氣管黏膜和肺 光鏡下支氣管黏膜廣泛壞死，上皮細(xì)胞脫落溶解，其間摻雜成熟粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞（圖1A），黏膜完整區(qū)域黏膜下層纖維組織結(jié)構(gòu)正常，炎性細(xì)胞少，局部扁平上皮細(xì)胞化生。電鏡下壞死組織中和上皮細(xì)胞內(nèi)偶見病毒顆粒（圖4A），壞死組織中有板層小體，1例患者上皮細(xì)胞同時(shí)含球菌和病毒顆粒。

肺組織廣泛實(shí)變，Ⅱ型肺上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)為主要成分（圖1B），Ⅰ型上皮細(xì)胞少，殘留肺泡腔內(nèi)大量脫落、壞死上皮細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞高度增生，充滿肺泡，空泡化明顯，肺泡和上皮細(xì)胞內(nèi)有大量板層小體（圖1C、1D、3A）。肺毛細(xì)血管數(shù)量少，部分壞死，周圍有大量滲出，血管腔內(nèi)有病毒顆粒。部分肺組織纖維化，成纖維細(xì)胞增多，周圍有大量束狀膠原（圖3B）。電鏡下Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均含病毒顆粒，細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重。

2.2.2 心肌和腓腸肌 心肌和腓腸肌部分組織損傷，肌細(xì)胞含脂滴，肌節(jié)紊亂，肌纖維排列紊亂、斷裂、溶解，自噬體形成；部分區(qū)域灶性壞死，肌細(xì)胞溶解壞死，結(jié)構(gòu)消失（圖2A、B）；部分區(qū)域肌組織纖維化，成纖維細(xì)胞增多，周圍有大量膠原。血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞和溶解，周圍滲出明顯；浦肯野纖維或細(xì)胞損傷（圖3C）。病毒顆粒分布于心肌和腓腸肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，壞死區(qū)域密度最高；組織結(jié)構(gòu)相對(duì)正常區(qū)域和結(jié)構(gòu)完整細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒少（圖4B、C）。

2.2.3 肝組織 肝細(xì)胞廣泛脂肪化或空泡形成，部分細(xì)胞出現(xiàn)不同程度核損傷或呈凋亡形態(tài)，核仁顯著，小葉中央靜脈周圍和匯管區(qū)肝細(xì)胞壞死，壞死和損傷部位炎性細(xì)胞少；血管周圍和肝竇內(nèi)滲出明顯，竇內(nèi)皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯（圖2C、2D、3D）。病毒主要分布于壞死和損傷區(qū)域肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝竇上皮細(xì)胞，以及巨噬細(xì)胞內(nèi)，損傷較輕和結(jié)構(gòu)完整細(xì)胞中病毒少，血管和竇腔偶見病毒（圖4D）。

2.2.4 病毒顆粒結(jié)構(gòu) 受累及組織細(xì)胞中H1N1病毒呈多形性，少數(shù)病毒結(jié)構(gòu)完整，直徑120 nm左右，由表到里依次為齒輪樣低密度蛋白殼、單層膜、空白間隙和高密度核酸蛋白芯；大部分病毒顆粒缺乏齒輪樣低密度蛋白殼，直徑100 nm左右，由單層膜、核酸蛋白芯和兩者間隙組成，間隙局部增寬時(shí)，顆粒外觀呈橢圓形；偶見絲狀或長(zhǎng)條形結(jié)構(gòu)，橫斷直徑與病毒核酸顆粒大小一致，周圍有病毒顆粒。

3 討論

本組12例患者有發(fā)熱、咳嗽和氣短，胸部影像顯示肺炎、肺間質(zhì)炎，4例有肺纖維化表現(xiàn)；血細(xì)胞分析除2例白細(xì)胞總數(shù)升高外，10例患者在正常范圍，咽拭子檢測(cè)甲型H1N1流感病毒陽(yáng)性，符合甲型H1N1流感病毒上呼吸道感染特點(diǎn)；血?dú)夥治觯?1例p（O2）降低，8例p（CO2）降低，說明大部分患者呼吸功能嚴(yán)重障礙。綜合臨床表現(xiàn)、肺部影像學(xué)及其他實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，本組患者病情明顯重于國(guó)內(nèi)報(bào)道平均水平[3]，符合重癥甲型H1N1流感病毒肺炎診斷要點(diǎn)[4]。5例死亡患者中4例合并肺部細(xì)菌感染，其中1例電鏡發(fā)現(xiàn)脫落和死亡的黏膜及肺泡上皮細(xì)胞中同時(shí)存在病毒和細(xì)菌，符合細(xì)菌感染與甲流患者病情加重和死亡相關(guān)的報(bào)道[5]。

美國(guó)有學(xué)者研究34例25～49歲甲型H1N1流感死亡患者肺病理，主要表現(xiàn)包括氣管炎、支氣管炎和彌漫性肺泡損傷，免疫組化和RT-PCR顯示氣管、支氣管、肺泡上皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞甲型H1N1流感病毒陽(yáng)性，部分患者合并細(xì)菌性肺炎[6]。這些特點(diǎn)與本組5例死亡患者支氣管和肺部分病理改變相同，說明流感病毒可引起不同年齡患者相同的呼吸系統(tǒng)病理?yè)p傷。此外，本組5例死亡患者支氣管鱗狀上皮局部化生，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生，充滿肺泡，成纖維細(xì)胞增生并合成大量膠原，使肺組織嚴(yán)重實(shí)變和纖維化，與日本報(bào)道的肺病理基本一致[7-9]，說明肺實(shí)變和纖維化是重型甲型H1N1流感病毒性肺損傷的重要病理特征，是患者呼吸功能衰竭的重要原因。

流感患者死因一般包括3個(gè)方面：（1）強(qiáng)大的病毒毒力，如1918年世界性大流感中多數(shù)患者數(shù)天內(nèi)死亡，2005年南亞H5N1禽流感中患者主要死于病毒性肺炎引起的急性呼吸窘迫綜合征[10]。（2）病毒感染誘發(fā)的繼發(fā)性細(xì)菌感染。（3）病毒感染導(dǎo)致的心、肺慢性疾病或糖尿病等基礎(chǔ)疾病加重。通常流感病毒沒有足夠毒力通過單獨(dú)侵犯肺部導(dǎo)致患者死亡，因此現(xiàn)在認(rèn)為1918年的大部分年輕流感患者死于繼發(fā)性細(xì)菌感染[5]。同樣，目前認(rèn)為甲型H1N1流感病毒肺炎繼發(fā)細(xì)菌性肺炎和基礎(chǔ)疾病加重是患者病情加重和死亡的主要因素。

自2009年甲型H1N1流感在全世界爆發(fā)以來，多數(shù)患者有不同程度肌痛，部分患者有心肌缺血、心律失常和心功能受損表現(xiàn)；病情較重患者血清LDH、α-HBDH、CK和AST升高[11]，這些病理特點(diǎn)已經(jīng)作為臨床診斷和重癥患者分類的重要指標(biāo)。這些病理變化普遍被認(rèn)為是病毒性肺炎誘發(fā)的多臟器損傷或原有基礎(chǔ)疾病加重所致[5]，尚少見病毒侵犯肺組織同時(shí)直接侵犯其他臟器以及此方面的病毒和病理研究報(bào)道。

本組12例患者發(fā)病后11例出現(xiàn)不同程度心律失常和心肌缺血，7例肌痛明顯，11例LDH和HBDH升高，6例CK升高，8例AST增高，提示心肌、其他系統(tǒng)肌肉或肝臟受累。光鏡和電鏡研究5例死亡患者心肌、肝臟和骨骼肌，發(fā)現(xiàn)各臟器除出現(xiàn)不同程度局灶性溶解和壞死外，損傷和壞死部位含大量病毒顆粒，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，損傷較輕或結(jié)構(gòu)正常部位病毒顆粒少，證實(shí)器官損傷與病毒直接侵入破壞有關(guān)，與繼發(fā)性損傷，尤其是單核/巨噬系統(tǒng)或淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系不大。CRP升高常見于細(xì)菌感染、組織損傷或壞死，以及心肌梗死和心功能不全，單純病毒感染多為陰性或弱陽(yáng)性，所以通常用于鑒別細(xì)菌與病毒感染。本組12例患者中10例顯著升高，一方面可能與多臟器損傷有關(guān)，另一方面與合并細(xì)菌感染相關(guān)。

綜上，筆者認(rèn)為甲型H1N1流感病毒不僅能直接感染肺組織，引起病毒性肺炎和嚴(yán)重肺損傷，而且可以侵犯多個(gè)器官，引起多臟器損傷和功能衰竭，導(dǎo)致患者病情加重和死亡。

Figure 1 Photos of bronchus and lung tissues圖1 支氣管和肺組織

Figure 2 Photos of myocardium,gastrocnemius and liver(HE staining)圖2 心肌、腓腸肌和肝組織（HE染色）

Figure 3 Photos of ultrastructural pathology圖3 超微病理

Figure 4 Photos of virus particles圖4 病毒顆粒

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.2009年12月份全國(guó)甲型H1N1流感防控工作情況[EB/OL].[2010-01-02].http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsyjbgs/s7863/201001/45434.htm.

[2]Ru YX,Zhao SX,Liu EB,et al.Ultrastructural characteristics of bone marrow in patients with hematological disease:a study of 13 cases[J].Ultrastruct Pathol,2007,31(5):327-332.

[3]Cao B,Li XW,Mao Y,et al.Clinical features of the initial cases of 2009 pandemic influenza A(H1N1)virus infection in China[J].N Engl J Med,2009,361(26):2507-2517.

[4]李冠華，張力，李月川，等.重癥甲型H1N1流感病毒肺炎的臨床和病理特征[J].天津醫(yī)藥,2010，38（1）:32-35.

[5]McCullers JA.Insights into the interaction between influenza virus and pneumococcus[J].Clin Microbiol Rev,2006,19(3):571-582.

[6]Gill JR,Sheng ZM,Ely SF,et al.Pulmonary pathologic findings of fatal 2009 pandemic influenza A/H1N1 viral infections[J].Arch Pathol Lab Med,2010,134(2):235-243.

[7]Mauad T,Hajjar LA,Callegari GD,et al.Lung pathology in fatal novel human influenza A(H1N1)infection[J].Am J Respir Crit Care Med,2010,181(1):72-79.

[8]Nakajima N,Hata S,Sato Y,et al.The first autopsy case of pandemic influenza(A/H1N1pdm)virus infection in Japan:detection of a high copy number of the virus in type II alveolar epithelial cells by pathological and virological examination[J].Jpn J Infect Dis,2010,63(1):67-71.

[9]Takiyama A,Wang L,Tanino M,et al.Sudden death of a patient with pandemic influenza(A/H1N1pdm)virus infection by acute respiratory distress syndrome[J].Jpn J Infect Dis,2010,63(1):72-74.

[10]Beigel JH,Farrar J,Han AM,et al.Avian influenza A(H5N1)infection in humans[J].N Engl J Med,2005,353(13):1374-1385.

[11]Perez-Padilla R,de la Rosa-Zamboni D,Ponce de Leon S,et al.Pneumonia and respiratory failure from swine-origin influenza A(H1N1)in Mexico[J].N Engl J Med,2009,361(7):680-689.