化學藥物誘導的大鼠急性腎損傷模型中腎損傷分子-1表達的研究*

汪蓓蕾 張 瑞 劉 妍 張金曉 郭 剛

近年來，國際腎臟病及急救醫學界趨向用急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）來取代傳統的急性腎衰竭（acute renal failure，ARF）這一概念，以強調對尚未進入腎衰竭階段的急性腎功能異常患者進行早期診斷和早期處理的重要性[1]。因此，選用易定量、高敏感性和可早期預測的腎損傷標志物至關重要。腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，Kim-1）是一類Ⅰ型膜轉運蛋白，包括胞漿區和含有Ig樣結構域及黏蛋白域的胞外區，可能參與了腎臟疾病的損傷及修復過程[2]。本研究通過對腎損傷模型中腎Kim-1基因和蛋白水平的研究，旨在為以尿Kim-1作為預測早期腎損傷的生物標志物提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 順鉑、慶大霉素（Sigma公司）；環孢素（諾華制藥）；Trizol、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、TaqDNA聚合酶（Invitrogen公司）；DNA Marker DL-2000（精美生物工程公司）；SYBR green MIX（Takara公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）、二硫蘇糖醇（DTT）、低熔點瓊脂糖（天津博美科生物技術有限公司）；PCR引物（上海生工生物工程公司）；羊抗大鼠Kim-1多抗（R&D公司）；小鼠抗β-actin單抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（博奧森公司）；醋酸纖維素膜、ECL試劑盒（millipore公司）；Contifuge 17RS臺式冷凍離心機（德國Heraeus公司）；GeneSnap凝膠圖像采集分析系統（SynGene公司）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）儀、垂直板電泳儀（Bio-Rad公司）。

1.2 動物分組和造模 雄性SD大鼠36只，SPF級，10～12周，體質量220～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產單位許可證編號：SCXK（京）2006-0009。試驗期間動物自由飲水，進食。SD大鼠按體質量分層后隨機分為順鉑、慶大霉素、環孢素腎損傷組和各對照組，每組6只。

1.2.1 順鉑誘導腎損傷模型 順鉑腎損傷組腹腔注射順鉑7.5 mg/kg，給藥體積為5 mL/kg，每日1次，連續給藥6 d；對照組以相同方式給予生理鹽水。取給藥6 d后大鼠腎臟組織，液氮速凍后，-80℃保存備用。

1.2.2 慶大霉素腎損傷模型 慶大霉素腎損傷組腹腔注射慶大霉素120 mg/kg，給藥體積為2 mL/kg，連續給藥12 d，每日1次；對照組以相同方式給予生理鹽水。取給藥12 d后大鼠腎臟組織，液氮速凍后，-80℃保存備用。

1.2.3 環孢素腎損傷模型 環孢素腎損傷組1～22 d灌胃給環孢素30 mg/kg，23～43 d皮下注射給藥17.5 mg/kg，44～52 d皮下注射給藥30 mg/kg；對照組以相同方式給予生理鹽水。取給藥52 d后大鼠腎臟組織，液氮速凍后，-80℃保存備用。

1.3 組織病理學檢查 腎組織經固定、脫水、石蠟包埋、切片（3 μm）后做常規HE染色。200或400倍光鏡下，觀察各組大鼠腎小管上皮組織形態的病理變化。腎小管病理變化由2個參數判定：（1）腎小管上皮細胞變性、壞死，小管擴張。（2）腎小管嗜堿性變。每個參數按0～4分評定：0分，正常；1分，極輕度受損，病變范圍<25%；2分，輕度受損，病變范圍25%～50%；3分，中度受損，病變范圍51%～75%；4分，重度受損，病變范圍>75%。

1.4 RT-PCR檢測大鼠腎臟組織Kim-1基因的表達

1.4.1 總RNA的提取和反轉錄合成cDNA 取大鼠腎臟組織100 mg，采用Trizol一步法進行腎組織總RNA的提取。利用分光光度計測定總RNA的吸光度（A）值，根據A260/A280和A260/A230的比值鑒定總RNA純度。利用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性。各管分別加入2 μg總RNA樣品，寡核苷酸Oligo（dT）181 μL（1 g/L），10 mmol/L dNTPs 1 μL，焦碳酸二乙酯（DEPC）水補齊，總體積12 μL。混勻后10 000 r/min瞬時離心5 s，65 ℃ 5 min后立即冰浴；加入5×Buffer 4 μL，0.1 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）2 μL，RNA酶抑制劑1 μL（40 U），混勻，37 ℃ 2 min，立即冰浴，再加入M-MLV 1 μL（200 U），總體積20 μL。混勻，10 000 r/min瞬時離心5 s，37 ℃ 50 min，70℃15 min，-20℃保存。

1.4.2 RT-PCR檢測Kim-1及管家基因GAPDH的表達水平 各引物序列利用Gene Runner軟件設計，經NCBI BLAST檢索無顯著同源性序列。Kim-1引物：上游5′-AG TCACCTATCGGAGCAG-3′，下游5′-GAACCATCCAGGAATC TC-3′， 擴增片段長度為135 bp；管家基因GAPDH：上游5′-A CAGCAACTCCCATTCTT-3′，下 游5′-TCCAGGGTTTCTTACT CC-3′，擴增片段長度為160 bp。采用Takara公司的SYBR green PCR試劑盒，反應體系：總體積20 μL，含SYBR green MIX 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水 7.0 μL；反應條件為：95 ℃預變性1 min；95 ℃10 s、退火（Kim-l 58.1℃；GAPDH 56℃）10 s、72℃ 10 s，進行40個循環。通過測定PCR產物的動態累積量，獲得樣品的擴增曲線。接著進行熔解曲線分析：95℃0 s，65℃15 s，95℃0 s，用待測樣品2-△CT值表示目的基因相對表達量[3（]CT是每個反應管內的熒光信號到達一定域值時所經歷的循環數；樣品△CT=目的基因CT值-GAPDH CT值）。RT-PCR擴增產物經2.0%瓊脂糖電泳鑒定，測序交由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.5 Western Blot法檢測大鼠腎臟組織Kim-1蛋白

1.5.1 膜蛋白Kim-1的提取 取100 mg腎組織在600 μL RIPA裂解液[1×PBS，1%Nonidet P-40，0.5% 去氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）1 mmol/L，乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）及蛋白酶抑制劑1 mmol/L苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF），20 μmol/L亮肽酶素]中充分勻漿后，12 000 ×g離心15 min后收集上清液。取少量上清利用PIERCE公司BCATM蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度，其余-80℃保存備用。

1.5.2 膜蛋白Kim-1的Western Blotting 以30 μg蛋白質與2X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液1∶1混合，100℃變性10 min，進行SDS-PAGE電泳。電泳后，將凝膠中的蛋白樣本轉移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，用適量的封閉液（5%脫脂奶粉溶于含0.05%Tween20的Tris-HCl緩沖鹽溶液TBS中），室溫震蕩1 h后4℃放置過夜。以wash buffer（含0.05%Tween20的TBS）清洗NC膜3次后將其置入一雜交袋中，加入封閉液稀釋的山羊抗大鼠Kim-1多抗（1∶400），4℃震搖過夜。NC膜經wash buffer漂洗3次后，加入HRP標記的兔抗山羊IgG二抗（1∶5 000）溶液，37℃震搖孵育1 h。最后用ECL法曝光顯影。DH-2000凝膠圖像系統進行圖像采集和數據處理。以β-actin作為內參照。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件處理試驗數據，所得數據以±s表示。各實驗組與其對照組之間比較進行t檢驗；不同實驗組之間比較進行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腎臟病理學改變 各藥物對照組的腎組織結構均呈正常，見圖1a、c、e；順鉑腎損傷組腎臟皮髓交界處均出現不等程度腎小管擴張，較多腎小管上皮細胞變性、壞死、脫落，基底膜裸露，腔內有大量紅染無結構的顆粒狀物質，較多腎小管腔內有蛋白管型，見圖1b，評分為3分。慶大霉素模型組大鼠腎小管擴張，腎皮質內大量腎小管變性、壞死，較多腎小管中可見蛋白管型，見圖1d，評分為2.3分。環孢素模型組大鼠腎臟內較多腎小管發生輕度嗜堿性變，見圖1f，評分為2分。鏡檢結果表明：由順鉑、慶大霉素及環孢素誘導的3個腎損傷模型均造模成功。

2.2 大鼠腎組織Kim-1及管家基因GAPDH RT-PCR擴增產物的鑒定 GAPDH、Kim-1 mRNA RT-PCR擴增產物經瓊脂糖電泳后，分別在160 bp、135 bp處出現目的條帶，見圖2、3。同時，RT-PCR陰性對照（反轉錄合成cDNA第一鏈時以水代替M-MLV）無擴增產物，排除了所提取RNA中基因組DNA的存在，見圖2。擴增產物測序結果與預期相符。

2.3 Kim-1和GAPDH的擴增曲線和熔解曲線 各組樣品的擴增曲線呈明顯的S形，曲線拐點清楚，而且在平臺期幾乎重合，說明獲得的擴增曲線良好。各熔解曲線未見雜峰，也未出現主峰的異常增寬，同時熔解峰（主峰）對應的Tm（DNA的解鏈溫度）值與擴增產物的理論Tm值相近，見圖4。

2.4 化學藥物誘導的腎損傷對腎組織中Kim-1 mRNA和蛋白水平的影響 各對照組腎Kim-1 mRNA表達水平顯著低于相應腎損傷組，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1。各模型組中均可檢測到腎Kim-1蛋白陽性表達，而對照組中均未檢測到，見圖5～7。順鉑組kim蛋白表達水平最高，慶大霉素組次之，環孢素組最低，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

Table 1 Expression levels of Kim-1 mRNA of renal tissues between two groups表1 各組大鼠腎組織Kim-1 mRNA的表達水平（n=6，±s）

Table 1 Expression levels of Kim-1 mRNA of renal tissues between two groups表1 各組大鼠腎組織Kim-1 mRNA的表達水平（n=6，±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別對照組腎損傷組t順鉑（4.45±1.08）×10-5（5.92±1.22）×10-2 7.465**慶大霉素（3.13±1.21）×10-4（8.39±2.65）×10-2 6.040**環孢素（2.29±1.21）×10-4（4.33±1.66）×10-3 2.656*

Figure 5 Results of Kim-1 protein expression detected by Western blot between DDP-renal injury model group and control group圖5 順鉑誘導腎損傷模型組和對照組Kim-1蛋白Western bolt結果

Figure 6 Results of Kim-1 protein expression detected by Western blot between GM-renal injury model group and control group圖6 慶大霉素誘導腎損傷模型組和對照組Kim-1蛋白Western bolt結果

Figure 7 Results of Kim-1 protein expression detected by Western blot between cyclosporine-renal injury model group and control group圖7 環孢素誘導腎損傷模型組和對照組Kim-1蛋白Western bolt結果

Table 2 Expression levels Kim-1 protein of renal tissues between two groups表2 各組大鼠腎組織Kim-1蛋白的表達水平（n=6，±s）

Table 2 Expression levels Kim-1 protein of renal tissues between two groups表2 各組大鼠腎組織Kim-1蛋白的表達水平（n=6，±s）

**P<0.01

組別 Kim-1/β-actin 統計學處理P順鉑組（1）慶大霉素組（2）環孢素組（3）F 28.557±11.122 8.779±0.997 0.770±0.168 29.522**<0.001<0.001 0.048組比（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）

3 討論

Kim-1在正常腎臟內微量表達，而在腎缺血或腎毒性急性損傷后會出現顯著變化：去分化近端小管細胞（proximal tubular cells，PTC）內Kim-l基因轉錄水平急劇上調，Kim-l蛋白也隨之大量表達，而隨著結構與功能的恢復，Kim-1這種高表達的現象也會消失[1]。除AKI外，慢性的腎損傷過程，如蛋白負荷腎病[4]和血管緊張素Ⅱ誘導的腎病[5]也會導致腎近端小管上Kim-1表達量增高。目前，對腎損傷時高表達Kim-1所發揮的具體功能還不清楚。Ichimura等[6]發現，AKI時Kim-1在吞噬凋亡細胞的過程中起到重要作用。這也證實了Kim-1作為一種磷脂酰絲氨酸受體可以誘導對凋亡細胞的吞噬作用的研究[7]。另外，尿中Kim-1在雙側腎缺血10 min后的第1天就可發生顯著性增高[8]，在急性腎小管壞死（acute tubule necrosis，ATN）時尿Kim-l能在鏡下發現任何管型之前被檢出，且可持續到恢復階段；而在糖尿病腎病和系統性紅斑狼瘡腎病患者中，尿Kim-l在出現明顯尿蛋白后也不會增加[9]。因此，尿Kim-l可成為檢測早期腎損傷的可靠生物學標志物。

本研究選用3種作用機制不同但都有明確腎毒性的化學藥物建立大鼠AKI模型。順鉑引起腎小管上皮細胞脂質過氧化、細胞內漿網鈣泵的控制受干擾、細胞核內糖體蛋白質的合成受抑制、溶酶體功能抑制及細胞內凝血等[9]；慶大霉素通過膜蛋白受體GP330（glycoprotein 330）介導的陽離子蛋白或受體內吞飲作用進入腎小管上皮細胞，形成的囊泡與初級溶酶體結合，使溶酶體膜通透性增加，以致酶大量漏出，繼而損害線粒體等細胞內結構[10]；環孢素誘導的腎毒性過程與前列腺素（PG）代謝失衡、腎素-血管緊張素系統激活、內皮素（ET）生成過多、一氧化氮（NO）量不足、反應性氧代謝產物（ROM）增加和腎臟抗氧化能力下降等因素有關[11]。在本研究中，3種藥物都導致了大鼠腎臟腎小管上皮細胞不同程度的變性、壞死，同時，腎Kim-1 mRNA和蛋白含量也都發生了顯著升高。順鉑組腎Kim-1在基因轉錄水平較對照組有約1 000倍的增高；慶大霉素誘導的腎損傷也造成了腎組織內的Kim-1 mRNA升高約260倍；環孢素腎毒性模型盡管在病理學上表現為較多腎小管輕度嗜堿性變，但其腎Kim-1基因轉錄水平增高了近19倍。由此可見，雖然3個模型的腎小管急性損傷由不同的機制導致，但是3個模型腎Kim-1 mRNA水平的增高程度隨病理學病變評分高低有相同的變化趨勢，且3組模型腎Kim-1蛋白表達水平亦然。

3種腎毒性藥物除了導致腎Kim-1 mRNA水平和蛋白含量顯著升高。Van等還發現尿中Kim-1含量與受損腎單元Kim-1蛋白表達量之間存在相關性的結論[4]；而有關Kim-1蛋白的細胞外域在基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）作用下裂解為可溶性片段而釋放到細胞外并排入尿中的發現[12]，則說明了腎毒性藥物誘導腎損傷時腎Kim-1的高表達與尿Kim-1含量升高之間的因果關系。

總之，本研究利用順鉑等化學藥物造成了大鼠腎小管上皮細胞變性、壞死等急性病變，并且從分子水平和蛋白水平檢測到腎Kim-1高表達，證明了由順鉑等化學藥物誘導的大鼠AKI與腎Kim-1高表達之間的存在直接相關性，并解釋了腎損傷模型中尿Kim-1含量增高的原因，為將尿Kim-1作為早期預測腎小管損傷的無創性生物指標提供了一定參考。

Figure 1 Histopathological examination of renal tissues(HE staining)圖1 腎組織病理學檢查（HE染色）

Figure 2 Product of GAPDH RT-PCR and negative control of 2%agarose gel electrophoresis圖2 GAPDH RT-PCR產物和陰性對照2%瓊脂糖凝膠電泳

Figure 3 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products of Kim-1圖3 Kim-1 RT-PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳

Figure 4 Amplification and melting curves of Kim-1 and GAPDH圖4 Kim-1和GAPDH的擴增曲線和熔解曲線

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