血小板微顆粒對人臍靜脈內皮細胞VEGF表達的影響*

解 暢 李曦銘 賈紅丹 張迎怡 毛用敏 崔讓莊 叢洪良

血小板微顆粒（platelet microparticles，PMPs）是血小板活化后脫落的一種膜顆粒，也是血小板活化的標志之一。以往的研究顯示PMPs參與以血管和血管發生為基礎的生物學過程，促進內皮細胞、平滑肌細胞等的增殖，抑制其凋亡，促進內皮細胞的遷移和生長，對于新生血管的形成有重要作用[1]。然而對PMPs誘導血管發生及內皮細胞增殖的機制研究甚少，對PMPs與內皮細胞作用的形式及下游轉導途徑闡述多屬間接。本實驗應用流式細胞術從富含血小板的血漿中提取高純度的PMPs，研究不同濃度PMPs及其與細胞作用不同時間對內皮細胞表達血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、其Ⅱ型受體KDR及其下游轉導通路重要酶的差異，探討PMPs影響內皮細胞VEGF表達及新生血管形成的可能機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 人臍靜脈內皮細胞系由天津市心血管病學研究所提供。流式細胞儀（BD FACS Calibur）及CD61a-FITC抗體購自美國BD公司；直徑1 μm的標準微球購自Sigma公司。UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒及實驗所需引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司。將人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）復蘇，在37℃、5%CO2的條件下常規培養，實驗采用3～4代細胞；按1×105/mL密度接種于9.6 cm2的6孔板中，生長接近100%時，進行PMPs的干預。提取PMPs的枸櫞酸鈉抗凝靜脈血均來源于天津市胸科醫院檢驗科，征得所有患者同意并簽署知情同意書。

1.2 PMPs的提取 枸櫞酸鈉抗凝靜脈血，800 r/min離心10 min，去除血細胞，上清為富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）。3 000 r/min 離心5 min，棄上清，沉淀為血小板，每管中加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、5 μL100 mmol/L Ca2+、200 mmol/L Mg2+懸浮混勻血小板。在不同血小板懸濁液中分別加入不同濃度的凝血酶和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP），通過預實驗，本實驗最終選用10 μmol/L ADP為激活劑，激活血小板，應用流式細胞儀檢測，比較血小板釋放PMPs數量，另設一管為對照管，不加入激活劑。共同37℃水浴20 min。4 600 r/min離心30 min，去除血小板凝聚物。將其上清液13 000 r/min離心60 min，得到去除血小板后純化的PMPs沉淀，用0.5 mL1×Tyrode’s Buffer懸浮。所得懸濁液中均加入20 μL CD61a-FITC抗體（為異硫氰酸熒光素標記的整合素b3型抗體，結合位點位于GPⅢα，購自Becton Drive公司），避光20 min上流式細胞儀檢測，并據此設定流式細胞儀檢測PMPs的各項參數及設門。

1.3 不同濃度PMPs干預內皮細胞CRL-1730 按參考文獻[1]方法配制PMPs不同干預濃度。選用DMEM/F12(購自GIBCO公司)完全培養基，內含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），100 U/mL青霉素+100 mg/L鏈霉素，在95%空氣和5%CO2混合氣體中常規培養。后以每孔CRL-1730細胞量為1×106分入9.6 cm2的6孔板中，24 h后換液，生長接近100%時，即內皮細胞約數為2.5×106時進行PMPs的干預。選取0、10、30、50、100 mg/L 5種不同干預濃度的PMPs作用于HUVECs，每個濃度4孔細胞樣本。將配制好的不同干預濃度的PMPs懸濁液每孔1 mL加入內皮細胞中。放入37℃5%CO2培養箱中孵育4 h。4 h后以0.5 mL PBS洗滌細胞，吸去PBS，加入0.5 mL 0.05%胰酶，37℃5%CO2培養箱保溫4～5 min，吹打細胞，轉移至離心管中，10 000 r/min離心3 min，棄上清，1 mL PBS洗細胞2次（每次離心10 000 r/min，3 min），離心獲得干預后的內皮細胞，-80℃凍存。

1.4 不同時間PMPs作用內皮細胞CRL-1730 PMPs濃度采取50 mg/L，每一作用時間共4孔細胞樣本，放入37℃CO2培養箱中分別孵育0、2、4、24 h。分別收集不同作用時間的細胞，步驟方法同前。

1.5 RT-PCR檢測 應用UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒提取上述制備好的凍存的HUVECs中總RNA，逆轉錄得到cDNA。VEGF、其受體KDR及其下游傳導通路中重要酶磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）以及胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）4種目的基因引物，見表1。PCR擴增其產物，觀察內皮細胞中4種因子mRNA的表達情況。瓊脂糖凝膠平板電泳法檢測PCR擴增產物，使用GEL-PRO凝膠成像分析系統對凝膠進行掃描，測量目的基因與內參基因擴增條帶的灰度值及比值。

Table 1 Gene primer design and length表1 目的基因引物設計及長度

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，計量數據以均數±標準差表示（±s）表示，多組均數之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度PMPs干預對CRL-1730 VEGF121、KDR、ERK、PI3K mRNA表達的影響 與0 mg/L組比較，不同干預濃度的PMPs均可顯著抑制內皮細胞VEGF121mRNA的表達（均P<0.05），增加內皮細胞KDR mRNA的表達（均P<0.05），ERK mRNA表達水平在PMPs 50 mg/L組顯著高于0 mg/L組（P=0.004），PI3K mRNA表達水平在PMPs100 mg/L組顯著高于0 mg/L組（P=0.004），見表2、圖1。

Table 2 Comparison of VEGF121,KDR,ERK and PI3K mRNA expression in endothelial cells intervened with different concentrations of PMPs表2 不同濃度PMPs對內皮細胞VEGF121、KDR、ERK及PI3K mRNA表達影響的比較 （±s）

Table 2 Comparison of VEGF121,KDR,ERK and PI3K mRNA expression in endothelial cells intervened with different concentrations of PMPs表2 不同濃度PMPs對內皮細胞VEGF121、KDR、ERK及PI3K mRNA表達影響的比較 （±s）

*P<0.05，**P<0.01

PMPs濃度干預組0 mg/L（1）10 mg/L（2）30 mg/L（3）50 mg/L（4）100 mg/L（5）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）VEGF121 0.746±0.179 0.486±0.055 0.539±0.089 0.533±0.062 0.399±0.105 6.047**0.003 0.015 0.013<0.001 KDR 0.451±0.072 0.623±0.104 0.615±0.120 0.633±0.063 0.750±0.141 4.200*0.034 0.041 0.026 0.001 ERK 0.749±0.205 0.829±0.190 0.778±0.238 1.141±0.093 0.961±0.103 3.327*0.505 0.809 0.004 0.121 PI3K 0.999±0.246 0.972±0.063 0.960±0.102 1.087±0.116 1.344±0.133 4.831*0.800 0.707 0.405 0.004

Figure 1 VEGF121，KDR，ERK and PI3K mRNA expression measured by RT-PCR圖1VEGF121、KDR、ERK、PI3K的RT-PCR產物電泳圖

2.2 PMPs干預不同時間對CRL-1730 VEGF121、KDR、ERK、PI3K mRNA表達的影響 干預4、24 h后與0 h組比較VEGF121表達差異有統計學意義（均P<0.05），而PMPs作用4 h、24 h卻可增加KDR mRNA的表達（均P<0.05）。PMPs作用于內皮細胞24 h后與0 h組比較可顯著增加內皮細胞PI3K mRNA的表達（P=0.004），見表3、圖2。

Table 3 Comparison of VEGF121,KDR,ERK and PI3K mRNA expression in the endothelial cells with different intervention times表3 不同干預時間PMPs對內皮細胞VEGF121、KDR、ERK及PI3K mRNA表達影響的比較 （±s）

Table 3 Comparison of VEGF121,KDR,ERK and PI3K mRNA expression in the endothelial cells with different intervention times表3 不同干預時間PMPs對內皮細胞VEGF121、KDR、ERK及PI3K mRNA表達影響的比較 （±s）

*P<0.05，**P<0.01

PMPs時間干預組0 h（1）2 h（2）4 h（3）24 h（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）VEGF121 0.746±0.179 0.669±0.060 0.530±0.123 0.318±0.091 9.320**0.380 0.023<0.001 KDR 0.451±0.072 0.580±0.087 0.637±0.063 0.634±0.135 3.710*0.064 0.013 0.021 ERK 0.749±0.206 0.800±0.146 0.978±0.136 0.562±0.206 3.577*0.667 0.071 0.132 PI3K 0.999±0.246 0.762±0.092 1.294±0.495 2.622±1.213 6.359**0.585 0.497 0.004

Figure 2 VEGF121，KDR，ERK and PI3K mRNA expression measured by RT-PCR圖2 VEGF121、KDR、ERK及PI3K的RT-PCR產物電泳圖

3 討論

PMPs是血小板被活化后釋放的微小顆粒，透射電鏡觀察PMP為直徑0.1～1.0 μm的小囊泡[2]。此微粒包括血小板表面蛋白質類及來源于血小板的部分胞質成分，均為有生物學活性的物質[3]，除凝血相關作用外，還可通過與靶細胞的相互作用啟動靶細胞的生物學效應。VEGF是最有力的血管生成因子，它通過和血管內皮細胞的特異性受體結合，具有強大的促內皮增殖、促血管生成作用，此外其還是一種趨化因子，使外向生長內皮細胞歸巢到血管損傷部位，修復損傷的血管[4]。Kim等[5]也證實了PMPs在體外有促進內皮細胞增殖、遷移、趨化和血管形成的功能。

Brill等[1]對PMPs促血管形成等進行了研究，主動脈環實驗顯示，在PMPs 30 mg/L時新血管萌芽的面積明顯高于對照組；PMPs50 mg/L及更高濃度時其誘導產生的血管萌芽面積與VEGF和bFGF誘導的血管面積相一致，進一步實驗顯示加入VEGF受體抑制劑可完全抑制PMPs所引起的新生血管萌芽（0.7 mm2vs 5.3 mm2），bFGF和PDGF中和抗體只能部分抑制新生血管形成（1.7 mm2vs 2.4 mm2），因此其認為PMPs促進新生血管形成過程中多種細胞因子發揮了重要作用，其中VEGF是關鍵因子。Brill等[1]也對PMP促血管生成的傳導通路進行了研究，認為至少有3個信號轉導因子是PMPs作用的關鍵點：Scr、PI3K和ERK，PMP內的細胞因子啟動了血管內皮細胞中的特殊信號轉導通路，誘發細胞增殖、移動和血管形成。

本研究與Brill等的實驗結論基本一致。在本研究中，采用了不同濃度PMPs對HUVECs進行刺激，結果顯示在培養的內皮細胞中加入PMPs進行刺激，細胞內VEGF mRNA的表達水平逐漸下降，與0 mg/L組比較差異有統計學意義。50 mg/L PMPs刺激0、2、4、24 h，內皮細胞中VEGF mRNA表達量隨時間延長逐漸下降，即內皮細胞自身的VEGF mRNA表達可能受到負反饋抑制而減少，而內皮細胞VEGFⅡ型受體（KDR）mRNA表達隨PMPs干預濃度上升明顯增加，VEGF下游兩條信號轉導通路中的兩個關鍵酶PI3K及ERK mRNA表達也隨PMPs濃度和時間的增加逐漸增高，表明被激活的信號轉導通路的上游配體VEGF可能不是來源于內皮細胞自身，而是來源于PMPs自身所釋放的。并且已有文獻證實，活化后的血小板微顆粒PMPs可以釋放血管內皮生長因子VEGF和成纖維細胞生長因子bFGF[6]，這可能是PMPs能夠啟動VEGF這一信號轉導通路，促進內皮細胞增殖的主要原因。最近的研究也證實，血管生成因子(VEGF和FGF-2)的水平和PMPs水平有著很強的相關性[7]。

PMPs是血小板脫落的膜顆粒，此微粒包含了血小板表面蛋白質類及來源血小板的部分胞質成分，PMPs可以介導血管原性的應答，來源于血小板微顆粒的多種細胞因子，如VEGF、堿性成纖維生長因子（bFGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）參與了血管的發生。隨著PMPs濃度的增加，VEGF釋放可能也隨之增加，VEGF與受體KDR結合后與PMPs未干預時比較可以顯著激活下游的PI3K/Akt和Ras信號轉導通路[8]，VEGF下游信號轉導通路PI3K和Ras途徑中的兩個關鍵酶PI3K及ERK mRNA表達也明顯升高，即PMPs可能通過PI3K/Akt及MAPK/ERK信號轉導途徑促進內皮細胞、平滑肌細胞等的增殖，抑制其調亡，參與以血管和血管發生為基礎的生物學過程。PMPs與類風濕性關節炎、尿毒癥、腫瘤、2型糖尿病、冠心病[9-10]等許多種疾病密切相關，其中很多機制與PMPs促進血管新生有關，深入研究必將對臨床相關疾病的治療起到一定作用。

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