稀土元素應(yīng)用于培養(yǎng)高含量DHA螺旋藻的試驗(yàn)研究*

余紹蕾，鴨 喬，張 瑤，萬(wàn)慶家

(云南綠A生物工程有限公司，云南昆明 650106)

DHA化學(xué)名稱(chēng)為二十二碳六烯酸，是Ω-3不飽和脂肪酸家族中的重要成員，是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞生長(zhǎng)及維持的一種主要元素，俗稱(chēng)“腦黃金”，具有預(yù)防和治療心血管疾病、癌癥和調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、視覺(jué)系統(tǒng)的功能，對(duì)胎兒、嬰兒智力和視力發(fā)育尤為重要［1］。目前雖對(duì)DHA的研究較多，但富含DHA的天然功能性食品開(kāi)發(fā)還較少，因此，開(kāi)發(fā)富含DHA的天然功能性食品具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。天然DHA主要來(lái)源于魚(yú)油、藻類(lèi)、干果類(lèi)等。其中，魚(yú)油受到產(chǎn)量、純化工藝、氣味等方面的影響，難以廣泛的應(yīng)用［2］。干果類(lèi)中所含的α-亞麻酸可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為DHA，但轉(zhuǎn)化效率僅為1%左右，難以被人體利用［3］。藻類(lèi)中富含 DHA，且易于被人體吸收，是人類(lèi)補(bǔ)充DHA的一種重要飲食來(lái)源。云南綠A生物工程有限公司致力于藻類(lèi)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，近年來(lái)一直在研究培養(yǎng)富含DHA的螺旋藻，以期開(kāi)發(fā)出富含DHA的螺旋藻類(lèi)產(chǎn)品，從而擴(kuò)大螺旋藻的應(yīng)用范圍，并為社會(huì)提供更多、更好的富含DHA的天然功能性食品。

在前期研究中，我們已從諸多的螺旋藻藻種中篩選出了適合我公司螺旋藻養(yǎng)殖基地養(yǎng)殖的富含DHA的螺旋藻藻種:Sp2002，其中DHA含量為7.88‰.為了進(jìn)一步提高該藻種中DHA的含量，我們繼續(xù)對(duì)其研究。稀土元素是元素周期表第Ⅲ族副族元素鈧系、釔系和鑭系元素共17種化學(xué)元素的合稱(chēng)，國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道［4-6］，添加適量的稀土元素，如:鈰 (Ce)、釤 (Sm)、鑭 (La)、釹(Nd)、釔 (Y)、鉺 (Er)等對(duì)于部分微藻 (小球藻、隱甲藻等)的生長(zhǎng)及其DHA合成具有明顯的促進(jìn)作用。在此基礎(chǔ)上，我們也進(jìn)行了在螺旋藻培養(yǎng)過(guò)程中添加稀土元素的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加適量且適合種類(lèi)的稀土元素對(duì)螺旋藻中DHA含量的提高有促進(jìn)作用，反之，則有抑制作用，甚至影響螺旋藻的生長(zhǎng)。目前，多種稀土元素合用的研究還較少，從理論上說(shuō)，多種稀土元素聯(lián)合使用，可發(fā)揮各自不同的作用，促進(jìn)螺旋藻的生長(zhǎng)，但由于稀土元素的特殊性，控制其添加量對(duì)于螺旋藻的生長(zhǎng)尤為重要。在本次研究中，我們采用正交試驗(yàn)的方法對(duì)幾種已篩選出來(lái)的稀土元素聯(lián)合應(yīng)用的用量進(jìn)行了研究，以期找到更合適培養(yǎng)高含量DHA螺旋藻的試驗(yàn)條件，為開(kāi)發(fā)出富含DHA的螺旋藻產(chǎn)品作準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

螺旋藻Sp2002藻種，螺旋藻培養(yǎng)液由云南綠A生物工程有限公司程海螺旋藻養(yǎng)殖基地提供;LaCl3·7H2O，Nd(NO3)3·6H2O，Ce(NO3)3·6H2O，Sm(NO3)3·6H2O由天津化工生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 螺旋藻的培養(yǎng)

在自然光照條件下通空氣培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，光暗周期12h:12小時(shí)。

1.2.2 稀土元素添加量的篩選

以每一種稀土元素作為一個(gè)因素，各種稀土元素的不同添加量為水平，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6，7］，La3+含量在 5 ～ 20mg/L，Ce3+含量在10mg/L以下，Sm3+含量在10mg/L以下，Nd3+含量在5～20mg/L的條件下對(duì)微藻中DHA含量的升高有促進(jìn)作用。我們?cè)谡辉囼?yàn)設(shè)計(jì)中選擇各種能夠促進(jìn)螺旋藻中DHA含量提高的稀土元素添加量進(jìn)行試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 稀土元素添加量正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 DHA含量的測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)GB/T5009.168-2003方法進(jìn)行測(cè)定。

(1)樣品處理:取10g螺旋藻干粉，置于60mL分液漏斗中，用60mL正己烷分3次萃取，合并提取液，在70℃水浴上揮至近干，用2～3mL正己烷分兩次將其轉(zhuǎn)移至10mL具塞比色管中，再加入2mL 2mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液，充分震蕩，并于50℃水浴中加熱1～2min，再加入2mL 2mol/L的鹽酸-甲醇溶液，充分震蕩，并于50℃水浴中加熱1～2min，定容至1mL，待上機(jī)檢測(cè)用。

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:精密稱(chēng)取DHA 50.0mg，加入正己烷溶解并定容至100mL，制成DHA標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取DHA標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0，2.0，5.0mL分別移入10mL具塞比色管中，再加入2mol/L的鹽酸-甲醇溶液2mL，充分震蕩，并于50℃水浴中加熱2min，棄去下層液體，再加約2mL蒸餾水洗凈并除去水層，用滴管吸出正己烷層，移至另一裝有無(wú)水硫酸鈉的漏斗中脫水，將脫水后的溶液在70℃水浴上加熱濃縮，定容至1mL，待上機(jī)測(cè)試用。

(3)檢測(cè)分析:檢測(cè)系統(tǒng):Agilent 6890氣相色譜儀;FID檢測(cè)器;色譜柱:玻璃柱1m×4mm(id)，填充涂有10%DEGS/Chromosorb WDMCS80目～100目的擔(dān)體;載氣與流速:氮?dú)?0mL/min，氫氣70mL/min、空氣100mL/min;汽化室溫度:250℃;檢測(cè)器溫度:300℃;進(jìn)樣量:1μl。

1.2.3 對(duì)比試驗(yàn)

采用常規(guī)培養(yǎng)方法，即不加稀土元素培養(yǎng)方法和正交試驗(yàn)確定的試驗(yàn)方法分別進(jìn)行3批小試試驗(yàn)，比較兩種方法培養(yǎng)的螺旋藻中DHA的含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，在4種稀土元素中，La3+對(duì)螺旋藻中DHA含量的提高作用影響最大，Sm3+對(duì)其影響最小。由極差分析可知，各因素對(duì)螺旋藻中DHA含量的提高作用影響的主次順序?yàn)?A＞B＞D＞C，即:La3+＞Ce3+＞Nd3+＞Sm3+。根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最佳條件為:A2B1C1D2，即各稀土元素濃度分別為:La3+10mg/L，Ce3+1mg/L，Sm3+2mg/L，Nd3+10mg/L。

2.2 對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

在原培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上按La3+10mg/L，Ce3+1mg/L，Sm3+2mg/L，Nd3+10mg/L的劑量添加稀土元素，試驗(yàn)結(jié)果表明，添加稀土元素后，螺旋藻中DHA含量有明顯提高，較原培養(yǎng)方法培養(yǎng)出的螺旋藻中DHA含量提高58.0%，經(jīng)t檢驗(yàn)，結(jié)果有顯著性差異。比較結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本次研究的結(jié)果表明，幾種稀土元素配合使用，對(duì)于螺旋藻內(nèi)DHA含量的升高有明顯的促進(jìn)作用，其中，在La3+10mg/L，Ce3+1mg/L，Sm3+2mg/L，Nd3+10mg/L的條件下培養(yǎng)，螺旋藻內(nèi)DHA含量較高。其作用可能是通過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)實(shí)現(xiàn)的:①多種低濃度的稀土元素誘導(dǎo)螺旋藻體內(nèi)形成核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶及其活化酶的復(fù)合體，提高CO2的同化效率，促進(jìn)螺旋藻光合碳同化，從而提高了螺旋藻的光合效率，增加了藻內(nèi)脂質(zhì)的積累，從而使DHA含量升高;②稀土元素取代Ca2+作為生物體的第二信使，通過(guò)鈣調(diào)蛋白參與一系列酶活性調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞分裂，連結(jié)穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)中磷脂與蛋白質(zhì);③清除藻內(nèi)自由基，保護(hù)藻細(xì)胞免受傷害;④稀土元素與蛋白質(zhì)、酶、多糖和核酸等生物大分子緊密結(jié)合，生成配合物，利于脂質(zhì)和蛋白的積累;⑤稀土元素對(duì)某些致病菌起到抑制作用，提高螺旋藻的質(zhì)量和產(chǎn)量。通過(guò)以上途徑，稀土元素促進(jìn)了螺旋藻的生長(zhǎng)和其中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的富集，從而提高其中DHA的含量。目前，對(duì)于稀土元素促進(jìn)螺旋藻內(nèi)DHA含量升高的作用機(jī)理尚不完全明確，還有待于進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn);稀土元素用于大規(guī)模培養(yǎng)富含DHA的螺旋藻也還有待于進(jìn)一步的研究，以尋找出最好的大規(guī)模培養(yǎng)條件。

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