淫羊霍苷對去卵巢骨質(zhì)疏松癥雌鼠的療效及機(jī)理初步研究＊

劉仕杰，莫新民△，李勁平，楊 軍，張小君

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410007;2.中南大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410013)

壯骨止痛方是本課題組開發(fā)的治療骨質(zhì)疏松癥的新藥，對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有良好療效［1］。課題組在確定復(fù)方有效部位的基礎(chǔ)上［2］，從其無水乙醇部位分離制備了淫羊霍苷，通過藥效學(xué)試驗(yàn)證明淫羊霍苷是其有效成分之一。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與飼料 3月齡SD雌性大鼠40只，體重250g左右，SPF級。飼料為標(biāo)準(zhǔn)普通飼料。動物和飼料均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物許可證號SCXK(湘)2009-0004)。

1.1.2 藥品與試劑 壯骨止痛方(原材料購自九芝堂，由中南大學(xué)藥學(xué)院制備)，淫羊霍苷(由中南大學(xué)藥學(xué)院制備，純度99.99%)，雌激素(HY-032)放免試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)。

1.1.3 主要儀器 Unigamma骨密度儀(意大利)，JY3002型電子天平，低溫離心機(jī)，LEICA DM LB2型雙目顯微鏡，超低溫冰箱，WDW-1000Ⅲ微機(jī)控制電子式萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)，MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，Motic B5顯微攝像系統(tǒng)和GC-1500r放射免疫計(jì)數(shù)器等。

1.2 方法

1.2.1 分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組10只，其他30只大鼠造模，術(shù)后1周將模型大鼠按體重隨機(jī)分為模型組、壯骨止痛方組和淫羊霍苷組，共4組。

1.2.2 造模方法［3］采用公認(rèn)的成年雌性大鼠去卵巢3個(gè)月絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型。造模方法:2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g體重)麻醉，在無菌的條件下從距離大鼠胸腰椎外側(cè)1cm處縱向切開皮膚及兩側(cè)肌肉，摘除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅在卵巢周圍切除相應(yīng)體積的脂肪，分兩層縫合傷口并用生理鹽水擦洗干凈血跡，術(shù)后連續(xù)3d大腿肌肉注射青霉素鈉，每只大鼠4萬u/d，術(shù)后5d拆線，飼養(yǎng)于室溫23℃ ～25℃、相對濕40% ～60%的清潔環(huán)境中，自由攝食和攝水。

1.2.3 給藥方法 各組均從拆線后開始給藥，每天灌胃1次，連續(xù)13周。假手術(shù)組和模型組每天灌胃相應(yīng)體積的冷開水和油中王牌植物油，壯骨止痛方組灌藥(水相 0.25ml/100g·d，油相 0.75ml/100g·d)，淫羊霍苷組灌藥(水相0.4ml/100g·d，油相0.6ml/100g·d)。劑量按各藥效相關(guān)物質(zhì)相對壯骨止痛方的得率及人鼠體表面積折算確定。

1.2.4 指標(biāo)檢測 連續(xù)灌胃13周，每10d稱1次體重，13周之后所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)，麻醉后腹部切口分離腹主動脈，用負(fù)壓采血管血 8ml，靜置 2h ～3h，3000r/min 離心15min后分離血清，以備放射免疫法檢測相關(guān)指標(biāo)。剖取左右后肢完整的脛骨及第2～4腰椎，去除上面附著的肌肉組織保留骨膜并做相關(guān)檢查。

血清E2檢測:(1)放射免疫法檢測血清 E2;(2)骨密度檢測:取第2～4腰椎骨用濕紗布包裹，送湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一院骨密度室檢測骨密度;(3)骨生物力學(xué)檢測:取右脛骨分干凈肌肉，用濕紗布包裹送國防科技大學(xué)物理系檢測骨最大抗彎曲強(qiáng)度;(4)骨組織病理學(xué)檢測:取左側(cè)脛骨用4%的多聚甲醛固定48h，然后用5%的硝酸脫鈣1周，送湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理檢驗(yàn)中心檢測脛骨的病理組織學(xué)形態(tài)變化，測量平均骨小梁密度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和Q檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P＜0.05具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 對去卵巢雌性骨質(zhì)疏松模型大鼠血清E2的影響

表1 對去勢骨質(zhì)疏松大鼠血清E2的影響

表1顯示，淫羊藿苷組與模型組相比明顯升高，差異具有顯著性意義(P＜0.05)。

2.2 對去卵巢雌性骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度的影響

表2 對去勢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

表2顯示，淫羊霍苷組腰椎骨密度與模型組相比明顯升高，差異有顯著性意義(P＜0.05)，與壯骨止痛方組比較無顯著差異性(P＞0.05)。

2.3 對去卵巢雌性骨質(zhì)疏松模型大鼠右脛骨骨生物力學(xué)的影響

表3 對去勢大鼠骨生物力學(xué)的影響

表3顯示，與模型組相比，淫羊霍苷組有提高右脛骨最大抗彎曲強(qiáng)度的趨勢，但無差異性(P＞0.05)。壯骨止痛方組能夠顯著提高右脛骨的最大抗彎曲強(qiáng)度(P＜0.01)，提高骨生物力學(xué)性能。

2.4 對去卵巢雌性骨質(zhì)疏松癥大鼠左脛骨骨組織形態(tài)學(xué)的影響

表4 對去勢大鼠左脛骨骨小梁密度的影響

表4顯示，在10×40倍鏡下，通過顯微形態(tài)學(xué)計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)測量骨小梁的密度，每張切片取5個(gè)視野，取其平均值。

病理切片表明，假手術(shù)組骨小梁分布均勻，股骨頸梁髓比正常。去卵巢模型組骨小梁稀疏、破壞，髓腔擴(kuò)大，梁髓比下降，說明壯骨止痛方組和淫羊霍苷組能提高骨小梁的分布和梁髓比。

圖1 大鼠左脛骨骨組織病理切片

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥屬于高代謝轉(zhuǎn)換型，即破骨細(xì)胞的骨吸收活動增強(qiáng)，骨吸收大于骨形成，因此絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)是破骨細(xì)胞數(shù)量的增加。淫羊藿苷是淫羊藿中含量最為豐富的黃酮苷類化合物，大量實(shí)驗(yàn)表明，淫羊藿苷具有抑制破骨細(xì)胞活性、增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性的作用。有研究表明［4］，淫羊藿苷可明顯改善骨質(zhì)疏松模型小鼠的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)證明［5］，通過采用MTT法做淫羊藿苷對離體人成骨細(xì)胞增殖的研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的淫羊藿苷對成骨細(xì)胞的生長增殖均有促進(jìn)作用，從而得出結(jié)論淫羊藿苷在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的同時(shí)，增強(qiáng)了成骨細(xì)胞成骨活性。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組和假手術(shù)組相比較，血清E2和腰椎骨密度明顯下降，差異有顯著性(P＜0.05)，骨小梁稀疏、破壞，髓腔擴(kuò)大，梁髓比明顯下降，差異顯著(P＜0.05)，右脛所能承受的最大壓力下降，差異顯著(P＜0.05)，說明大鼠去卵巢后不僅有骨量的減少，還有骨強(qiáng)度的下降，這些特征與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的生理改變類似，說明本實(shí)驗(yàn)中的病理模型復(fù)制成功。

給藥后與模型組相比，淫羊霍苷組血清E2增高和骨密度增加明顯(P＜0.05)，骨小梁密度顯著提高(P＜0.05)，提高了骨小梁的分布和梁髓比，說明淫羊霍苷能有效地抑制去勢后骨量的丟失。骨生物力學(xué)性能未見顯著提高(P＞0.05)，但從結(jié)果分析有提高的趨勢，說明淫羊藿甘對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松具有良好的療效。

雌激素的減少可導(dǎo)致相應(yīng)的免疫功能自穩(wěn)平衡被破壞，激活和增殖T細(xì)胞，促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成。雌激素缺乏時(shí)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子、破骨細(xì)胞分化因子表達(dá)增加，T細(xì)胞增多，腫瘤壞死因子、白介素1產(chǎn)生增多，破骨細(xì)胞分化增殖增多，生存期延長，骨吸收增強(qiáng)，同時(shí)成骨細(xì)胞凋亡增多，骨形成不足以代償骨吸收，使骨量減少，骨小梁變細(xì)，小梁間隙增寬，發(fā)生骨質(zhì)疏松［6］。胸腺缺如的T細(xì)胞缺乏的小鼠與正常小鼠比較，去卵巢術(shù)后(ovariectomy，OVX)不伴有破骨細(xì)胞的增加，胸腺缺如對OVX誘導(dǎo)的骨量減少和骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的增加有保護(hù)作用。TNF-α-/-的OVX小鼠不發(fā)生骨量減少，而將野生型小鼠的T細(xì)胞移植給胸腺缺如的小鼠可恢復(fù)OVX誘導(dǎo)的骨量減少，但自 TNF-α-/-小鼠移植的 T細(xì)胞則不能恢復(fù)OVX誘導(dǎo)的骨量減少，提示T細(xì)胞介導(dǎo)了雌激素缺乏對破骨細(xì)胞的刺激作用以及對骨重建的作用［7］，這說明雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥是通過T細(xì)胞來發(fā)揮作用的，T細(xì)胞對破骨細(xì)胞的形成具有主導(dǎo)作用。

本實(shí)驗(yàn)提示，淫羊霍苷具有明顯提高血清E2的含量，具有差異性(P＜0.05)，其治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)雌激素水平，從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化而發(fā)揮作用，具體過程還有待更進(jìn)一步的研究。

［1］莫新民，曾 英，彭瓊輝，等.壯骨止痛膠囊治療去卵巢雌鼠骨質(zhì)疏松癥療效的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2007，13(3):195-198.

［2］甘國興，莫新民，李勁平，等.壯骨止痛方藥效部位的篩選及其對骨質(zhì)疏松雌鼠骨代謝相關(guān)激素的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(15):126-130.

［3］魏玉芳，王長海，劉鈺林，等.補(bǔ)腎法對大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(6):544-545.

［4］張金娟，文 娛，張貴林，等.淫羊藿苷對骨質(zhì)疏松模型小鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響［J］.貴州醫(yī)藥，2010，34(5):404-405.

［5］于 波，楊久山，劉 巖，等.淫羊藿苷對人成骨細(xì)胞的作用［J］.中醫(yī)正骨，2006，18(6):17-18.

［6］邢小平，王 鷗，韓桂艷.代謝性骨病與免疫［J］.臨床內(nèi)科雜志，2007，24(3):149-152.

［7］Cenci S，Weitzmann MN，Roggia C，et al.Estrogen deficiency induces bone loss by enhanceing Tcell production of TNF-α［J］.J Clin Invest，2000，106:1229-1237.