實時定量PCR檢測自然流產(chǎn)患者HLA-G mRNA的表達

陳小梅，汪 泓，余彩鈴，王 萍

(皖南醫(yī)學院 1.醫(yī)學一系;2.免疫學與微生物學教研室，安徽 蕪湖 241002)

人類白細胞抗原-G(HLA-G)是一種具有獨特分子結(jié)構(gòu)的非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子，主要表達于絨毛外細胞滋養(yǎng)層上，具有較低的多態(tài)性，在誘導母胎免疫耐受中發(fā)揮重要作用，可抑制NK細胞及T細胞的殺傷作用，調(diào)節(jié)細胞因子的釋放和誘導T細胞凋亡。近來研究均表明在不明原因的習慣性流產(chǎn)、妊娠高血壓綜合征等病理妊娠中HLA-G存在異常表達。本文采用實時熒光定量PCR檢測自然流產(chǎn)與正常妊娠人工流產(chǎn)患者的絨毛組織中HLA-G mRNA表達水平，以探討 HLA-G與自然流產(chǎn)的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 隨機選取2010年5～8月在宣城地區(qū)醫(yī)院及蕪湖市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科進行自愿人工流產(chǎn)或自然流產(chǎn)的胚胎組織，其中人工流產(chǎn)的胚胎組織8例(對照組)，孕婦平均年齡(29.96±6.08)歲，平均孕周(7.54 ±0.76)周。自然流產(chǎn)患者的胚胎組織6例(實驗組)，患者平均年齡(27.56±6.99)歲，平均孕周(8.11 ±1.10)周。經(jīng)婦科超聲檢查、內(nèi)分泌檢查均無異常，排除感染、遺傳、全身疾病，抗心磷脂抗體(ACA)、抗精子抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體均為陰性，夫妻雙方染色體、免疫檢查正常。

1.1.2 主要試劑 Simply P總RNA抽提試劑盒(BioFlux生物有限公司產(chǎn)品)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司產(chǎn)品)，SYBR? Green Realtime PCR Master Mix(購自上海東洋紡科技有限責任公司)，Bio S50(Bioflux公司產(chǎn)品)，6×Loading Dye solution(Fermentas公司產(chǎn)品)。

1.1.3 Real-time PCR 擴增引物 HLA-G(目的基因)引物、β-actin(β-肌動蛋白，內(nèi)參照)引物(見表1)由上海生工合成。

表1 HLA-G、β-actin的引物Tab 1 Primers for HLA-G and β-actin amplification

1.2 方法

1.2.1 標本保存 取胚胎組織后，用無菌生理鹽水清洗血污，置于密封無菌保鮮袋中，置－70℃低溫冰箱保存。

1.2.2 絨毛組織總RNA的提取 自－70℃低溫冰箱取出胚胎組織標本，于20℃室溫緩慢解凍，用DEPC水配制的0.85%NaCl溶液清洗，剪取絨毛組織，剪碎，放入組織研磨器中，具體操作按總RNA抽提試劑盒說明書進行。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 取2 μl總 RNA(1 μg/L)，并嚴格按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將總mRNA反轉(zhuǎn)錄成總cDNA。陽性對照為GAPDH RNA。

1.2.4 Real-time PCR的半定量分析 向反應管中加入 ddH2O 6.4 μl，SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 10 μl，10 mol/L 上下游引物各0.8 μl，cDNA 模板2 μl，反應體系總體積為 20 μl。儀器使用羅氏lightCycler 2.0。循環(huán)條件為:95℃，30 s;40個循環(huán)，95℃，5 s;55℃，10 s;72℃，15 s;熒光檢測。以β-actin基因的表達量作為內(nèi)參，校正HLA-G基因的表達量，計算公式為:相對表達量=2－△Ct，△Ct=(目的基因Ct值－內(nèi)參基因Ct值)。

1.2.5 Real-time PCR反應特異性鑒定 取15 μl擴增產(chǎn)物與3 μl上樣緩沖液，點樣于1.5%瓊脂糖凝膠上(含 EB 0.5 μg/ml)，在0.5 × TBE 緩沖液中電泳，用Bio S50作為分子大小參照物，100 V穩(wěn)壓電泳30 min，自動凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD Laboratories-Segrate)進行拍照。

1.2.6 結(jié)果計算與統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，兩組比較采用t'檢驗，以P＜0.05示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR結(jié)果 自然流產(chǎn)組絨毛組織中的HLA-G mRNA的相對表達量明顯低于正常妊娠早孕人工流產(chǎn)組，差異有統(tǒng)計學意義(t'=－2.959，P ＜0.05)，見表2。

表2 自然流產(chǎn)與正常妊娠早孕人工流產(chǎn)HLA-G mRNA表達的差異(±s)Tab 2 Difference of HLA-G mRNA expression in cases between spontaneous abortion and normal pregnancy(±s)

表2 自然流產(chǎn)與正常妊娠早孕人工流產(chǎn)HLA-G mRNA表達的差異(±s)Tab 2 Difference of HLA-G mRNA expression in cases between spontaneous abortion and normal pregnancy(±s)

組別 例數(shù)(n)HLA-G mRNA(Ct均值)β-actin(Ct均值)△Ct值 相對表達量(2－△Ct )正常妊娠早孕人工流產(chǎn) 8 26.813 ±5.814 26.354 ±4.148 0.459 ±2.266 1.883 ±1.774自然流產(chǎn) 6 29.956 ±0.992 24.558 ±0.736 5.398 ±0.598 0.026 ±0.012

2.2 Real-time PCR鑒定結(jié)果 β-actin與HLA-G電泳譜較亮且無拖尾現(xiàn)象。β-actin擴增出147 bp左右的產(chǎn)物，HLA-G擴增出106 bp左右的產(chǎn)物。電泳結(jié)果見圖1。

3 討論

實時熒光定量PCR技術(shù)目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領(lǐng)域，是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后對未知模板進行定量分析的方法，其有絕對定量和相對定量之分。絕對定量指用已知的標準曲線來推算未知的樣本量;相對定量指在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列的量的變化，其又分為相對標準曲線法和比較Ct法。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有快速、靈敏度高、特異性強、重復性好、定量準確等優(yōu)點。

圖1 Real-time PCR產(chǎn)物電泳圖Fig 1 Electrophoregram of the real-time PCR products

HLA-G與妊娠的免疫耐受有著密切的關(guān)系，可通過多種機制誘導母胎間免疫耐受，尤其是對母胎界面中的免疫活性細胞(NK細胞、T細胞、B細胞、抗原提呈細胞以及內(nèi)皮細胞等)間的調(diào)節(jié)作用，使胎兒免遭母體T淋巴細胞和NK細胞的攻擊，維持正常妊娠［1］。Yie 等［2］回顧性研究發(fā)現(xiàn)，分泌 sHLA-G的胚胎卵裂率活產(chǎn)率顯著高于sHLA-G缺乏者。認為胚胎sHLA-G水平和卵裂率對妊娠結(jié)局具一定預測價值。大多學者認為HLA-G表達異常將會導致反復自然流產(chǎn)［3］。范倩等［4］采用ELIAS法測得自然流產(chǎn)患者血清中sHLA-G明顯低于正常妊娠者。邵劍春等［5］采用實時熒光定量PCR技術(shù)分別檢測正常妊娠人工流產(chǎn)患者、單次自然流產(chǎn)患者、原因不明復發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛中HLA-G mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)適量的HLA-G mRNA表達水平有利于維持妊娠，而低的HLA-G mRNA表達水平可能會使胚胎在植入過程中容易被母體的免疫細胞攻擊，而引起流產(chǎn)。朱曉明等［6］采用實時熒光定量PCR及Western印跡兩種方法對重度子癇前期患者及正常妊娠胎盤組織中的HLA-G mRNA及蛋白進行定量，發(fā)現(xiàn)子癇前期患者胎盤中HLA-G mRNA及蛋白水平明顯低于正常妊娠。Emmer等［7］發(fā)現(xiàn)，習慣性流產(chǎn)的婦女HLA-G的表達較健康妊娠者降低，同時外周血和蛻膜的NK細胞的含量升高，還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)管畸形的胎兒羊水中sHLA-G分子的含量降低。黃潔紅等［8］在用實時熒光定量PCR檢測反復自然流產(chǎn)絨毛組織中HLA-G及其各亞型的表達中，發(fā)現(xiàn)反復自然流產(chǎn)絨毛組織中總HLA-G mRNA較正常妊娠顯著降低，以 HLA-G1，HLA-G3 降低為主。Goldman 等［9］通過RNA原位雜交法研究也發(fā)現(xiàn)，反復自然流產(chǎn)患者絨毛組織較正常妊娠婦女HLA-G mRNA的表達下降或缺失。

本研究采用實時定量PCR檢查方法中的比較Ct法對自然流產(chǎn)及正常妊娠人工流產(chǎn)絨毛組織中HLA-G mRNA進行定量，結(jié)果表明自然流產(chǎn)組HLAG mRNA表達明顯低于正常妊娠早孕人工流產(chǎn)組(P＜0.05)。此結(jié)果提示這一異常可能與自然流產(chǎn)的發(fā)病與病理生理過程有關(guān)，符合目前國內(nèi)外研究結(jié)果，為研究自然流產(chǎn)發(fā)病機理、診斷及治療開辟了新的途徑。

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