鳳眼蓮總黃酮微波提取工藝的研究

戶 勛，余 萍，張 慾

(1．福建農林大學植物保護學院，福建福州350002;2．福建師范大學化學與材料學院，福建福州350007;3．福建農林大學計算機與信息學院，福建福州350002)

鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)屬雨久花科，鳳眼蓮屬，多年生宿根浮水草本植物(Kathiresan，2000)。因其在根與葉之間有一個個像葫蘆狀的大氣泡又稱水葫蘆，又名布袋蓮、水浮蓮、水荷花、假水仙，為漂浮生惡性雜草(Holms et al，1977)。水葫蘆原產于南美，19世紀期間引入東南亞，1901年作為花卉引入中國(刁正俗，1990)。20世紀30年代，水葫蘆作為畜禽飼料由臺灣引入中國大陸，并作為觀賞和凈化水質的植物在中國南方各省推廣種植，后逃逸為野生(丁建清，1995)，并已擴散到溫帶地區，成為我國淡水水體中主要的外來入侵物種之一。鳳眼蓮主要在中國南方分布，由于北方河流有凍結期，鳳眼蓮無法在自然狀態下生存。但近年來，隨著全球變暖和它的自然選擇進化，其危害區有向北拓展的趨勢。

天然黃酮類化合物是植物體中多酚類的內信號分子及中間體或代謝物。由于黃酮類化合物廣泛分布于植物中，其生理活性多種多樣，引起了國內外廣泛注意，研究進展很快。目前從天然產物中分離到并確定的黃酮數目達8000多種。大量研究證明:黃酮類化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎癥、抗過敏、抗糖尿病并發癥等多種生理活性及藥理作用，且無毒無害，對人類的腫瘤、衰老、心血管病等疾病的治療和預防有重要的意義。此外，還可用作食品、化妝品的天然添加劑、如甜味劑、抗氧化劑、食用色素等。因此，成為近幾年研究、開發、利用的熱點，其在醫藥、食品領域具有廣闊的應用前景(屠鵬飛等，1996;陳維杻，1998;丁利君等，2002)。

黃酮類化合物的提取通常采用水提取和極性溶劑提取兩種方法(Hu and Skibsted，2002)。極性溶劑易滲入至原料的內部，提取效果要好于水提取法。極性溶劑中，乙醇的食用安全性高，價格較低，可回收再利用。本文選定乙醇作為鳳眼蓮總黃酮的提取溶劑(李彩俠等，2006)，采用微波法(王娟等，2002;范志剛等，2000)從鳳眼蓮干粉中提取總黃酮。因目前天然產物總黃酮的提取對熱水浸提法和超聲波法報道較多，而微波法方面的資料極少。因此本研究決定在微波法的基礎上進行正交試驗，進一步探討微波法提取總黃酮的最佳提取條件。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)取自福建農林大學池塘。

1．2 試驗方法

1．2．1 原料預處理 將鳳眼蓮整株去根、去腐敗和枯黃部分后洗凈曬干，用剪刀絞成小段后置于烘箱烘干，然后粉碎，再置于烘箱烘干，保存于干燥器中備用。

1．2．2 微波法提取鳳眼蓮總黃酮的工藝流程

1．2．3 微波法提取鳳眼蓮總黃酮的單因素試驗 準確稱取若干鳳眼蓮干粉于微波爐用碗(帶蓋)中，加入乙醇溶液，微波處理，抽濾定容，作為待測液。此項試驗分別以不同的乙醇濃度、微波時間、料液比、微波火力為單因素進行。

1．2．4 鳳眼蓮待測液中總黃酮含量的測定

(1)分析方法與原理

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測定總黃酮的含量。黃酮類化合物中含有堿性氧原子，一般又多帶酚性羥基，能與金屬鹽類試劑如鋁鹽、鉛鹽、鎂鹽和鐵鹽等形成顏色較深的絡合物，在一定波長下有最大吸收峰，在此波長下可以進行比色分析。加入的NaNO2起還原劑作用，防止黃酮類化合物受氧化而損失。

(2)蘆丁標準溶液最大波長的選擇

分別準確稱取經105℃干燥至恒重的蘆丁10 mg、15 mg、20 mg，用30%的乙醇溶解完全并定容于100 mL容量瓶中，搖勻得濃度分別為0．1 mg/mL、0．15 mg/mL、0．2 mg/mL標準溶液，備用。分別取上述蘆丁標準溶液各5 mL于50 mL容量瓶中，用30%乙醇補充至20 mL，加入 NaNO2(1:20)溶液 1．5 mL，搖勻，放置5 min 后加入 Al(NO3)3(1:10)溶液1．5 mL，搖勻，放置6 min后再加入10 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻，用30%乙醇定容至刻度，10 min后于紫外分光光度計450-700 nm波長范圍內進行掃描，以空白試劑為參比，確定最大吸收波長λmax。

(3)乙醇提取液最大吸收波長的選擇

取制備好的乙醇提取液和蘆丁標準品溶液(0．1 mg/mL)各5mL分別置于2個50 mL容量瓶中，各加入30%乙醇溶液補充至20 mL，加入NaNO2(1:20)溶液1．5 mL，搖勻，放置5 min后加入Al(NO3)3(1:10)溶液1．5 mL，搖勻，放置6 min后再加入10 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻，用30%乙醇定容至刻度，10 min后于波長510 nm處比色測定，參比為空白試劑。在450 nm-700 nm之間掃描其吸光度值，檢測吸光度峰值出現情況。

(4)蘆丁標準工作曲線的繪制

準確稱經105℃干燥至恒重的蘆丁5．0 mg，用30%的乙醇溶解完全并定容于50 mL容量瓶中，搖勻得濃度為0．1 mg/mL標準溶液，分別精取該蘆丁標準溶液0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL放入7只50 mL容量瓶中，各加入30%乙醇溶液補充至20 mL，加入NaNO2(1:20)溶液 1．5 mL，搖勻，放置5 min 后加入 Al(NO3)3(1:10)溶液 1．5 mL，搖勻，放置6 min后再加入10 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻，用30%乙醇定容至刻度，10 min后于波長510 nm處比色測定，參比為空白試劑。以蘆丁標準溶液的質量濃度C與吸光度A繪制標準曲線，或采用二元線性回歸法求回歸方程。

(5)待測液中總黃酮含量的測定

準確吸取5 mL鳳眼蓮總黃酮待測液置于50 mL容量瓶中，按上述方法測定其吸光度，由(4)得到的標準曲線線性回歸方程計算出總黃酮的質量濃度C，再換算成鳳眼蓮干粉的總黃酮提取率e。

式中A為待測液定容量(mL)，B為吸取測定量(mL)，C為線性計算出的濃度，D為測定時定容量(mL)，E為稱量鳳眼蓮干粉量(g)。

1．2．5 微波法正交試驗 取1 g鳳眼蓮干粉，在微波法的單因素基礎上，進行進一步的正交試驗，以提取液中總黃酮的含量高低為考察指標，確定鳳眼蓮干粉中總黃酮提取的最佳條件。

2 結果與分析

2．1 蘆丁標準溶液最大波長

濃度為 0．1 mg/mL、0．15 mg/mL、0．2 mg/mL 的蘆丁標準溶液經 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法后的紫外吸收光譜見圖1。

從吸收光譜圖1中可以看出，蘆丁標準溶液在波長510 nm處具有最大吸光度，且吸收范圍較寬，與文獻報道一致，所以選擇吸收波長510 nm作為定量測定波長。

圖1 不同濃度溶液的吸收光譜Figure 1 The absorption spectrum of different concentration rutin

2．2 乙醇提取液最大吸收波長

蘆丁標準品溶液制成顯色檢測液，檢測波長的掃描從波長700 nm開始，在510 nm處出現峰值，如圖2所示。乙醇提取液制成顯色檢測液，檢測波長的掃描從700 nm開始，在510 nm處出現峰值，如圖2所示。

結果表明蘆丁標準品溶液和乙醇提取液制成顯色檢測液后最大吸收波長一致，均為510 nm，故確定510 nm為總黃酮顯色檢測液的測定波長。

圖2 蘆丁標準品與乙醇提取液顯色檢測液在可見光波長為450－700 nm之間掃描結果Figure 2 Results of scanning solution of sophorin standard preparation and sample at wavelength of 450-700 nm

2．3 蘆丁標準工作曲線

以蘆丁標準溶液的濃度C與吸光度A作圖，如圖3所示。用最小二乘法進行線性回歸得蘆丁濃度C(mg/mL)與吸光度A的標準曲線回歸方程式:A=0．00128+10．75625C，相關系數R=0．99968。表明本方法線性關系良好，可作為鳳眼蓮總黃酮含量的測定方法。

2．4 微波法單因素試驗并測定總黃酮含量

2．4．1 乙醇濃度對總黃酮提取的影響 分別準確稱取1．0 g鳳眼蓮干粉，加入體積濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇溶液40 mL，在中低火檔微波提取3 min。探討乙醇濃度對總黃酮提取的影響，結果如圖4所示。

總黃酮提取量在乙醇濃度為40%前上升較快，而后趨于平緩，并且當乙醇濃度過高時，提取量下降明顯。這可能是因為乙醇濃度過高，在微波條件下易揮發失去，導致總黃酮溶出降低。40%與70%兩處總黃酮提取量都比較高，基于節約溶劑和環保，本試驗選擇40%的乙醇溶液。

圖3 蘆丁標準工作曲線圖Figure 3 The standard curve of rutin

圖4 乙醇濃度對總黃酮提取的影響Figure 4 The influence of different density on extraction

2．4．2 微波時間對總黃酮提取的影響分別準確稱取1．0 g鳳眼蓮干粉，加入體積濃度為40%的乙醇溶液40 mL，在中低火檔微波提取 1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min。探討微波時間對總黃酮提取的影響，結果如圖5所示。

總黃酮的提取量總體上隨著時間的延長而升高，在4 min時提取量最大，時間再延長呈下降趨勢。這可能是由于微波時間太長引起溫度升高造成乙醇揮發，以及微波對總黃酮結構破壞造成損失導致的，故以4 min為適宜微波時間。

圖5 微波時間對總黃酮提取的影響Figure 5 The influence of microwave time on extraction

2．4．3 料液比對總黃酮提取的影響 分別準確稱取1．0 g鳳眼蓮干粉，加入體積濃度為40%的乙醇溶液 20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL，在中低火檔微波提取4 min。探討料液比對總黃酮提取的影響，結果如圖6所示。隨著乙醇溶液體積的增大，總黃酮的提取量呈明顯的上升趨勢，一直到1:80后才出現平緩的走向，基于節約溶劑和回收，本試驗選擇了1:80為適宜的料液比。

2．4．4 微波火力對總黃酮提取的影響 分別準確稱取1．0 g鳳眼蓮干粉，加入體積濃度為40%的乙醇溶液40 mL，在低火、中低火、中火、中高火、高火檔微波提取4 min。探討微波火力對總黃酮提取的影響，結果如圖7所示。

可以看出，火力越高越不適宜總黃酮的提取，可能是由于溫度過高導致溶劑損失嚴重反而不利于總黃酮溶出等原因引起的，故選擇中低火較為適宜。

單因素試驗結果表明各單因素最適宜條件如下:微波時間4 min、乙醇濃度40%、料液比1:80、微波火力 M．Low。

圖6 料液比對總黃酮提取的影響Figure 6 The influence of solid and solution ratio on extraction

圖7 微波火力對總黃酮提取的影響Figure 7 The influence of microwave firepower on extraction

2．5 微波法正交試驗

2．5．1 正交試驗 綜合微波法單因素試驗的最適宜條件，選用L9(34)表進行正交試驗，以提取液中總黃酮的含量高低為考察指標，確定鳳眼蓮干粉中總黃酮提取的最佳條件。因素與水平設計見表1。正交試驗結果見表2。

表1 L9(34)正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可直接看出，其中以試驗號3所得的粗提液中總黃酮的含量最高，100 mL的粗提液中含總黃酮9．75 mg，即A1B3C3D3為較好的工藝。從極差R值的大小可以看出粗提液中總黃酮含量影響的大小順序依次為B-乙醇濃度(%)、C-料液比、D-微波火力、A-微波時間(min)。因此從計算結果可以得出，A1B3C2D2為最佳條件。

由于正交表中所有的列都被因素占據，沒有空白列，從而無法得到誤差的估計，對于這種情況應取各列偏差平方和最小的近似當作誤差的估計(上海市科學技術交流站，1975)。因素A的極差較小，所以將此列作為方差分析的誤差列，對正交后的結果進行方差分析(中國科學院數學研究所統計組，1977)，詳見方差分析表3。

方差分析結果表明，在所設的不同水平的乙醇濃度下，其提取效果有非常顯著的差異，料液比的影響達到顯著水平。但A1B3C2D2不包括在正交試驗設計表內，因此通過驗證試驗證明該條件下所得的總黃酮含量是否比試驗號3更高。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

2．5．2 乙醇濃度對總黃酮提取的影響 在A1B3C2D2工藝下驗證試驗，結果見表4。

表4 驗證試驗Table 4 The result of verifiability test

在A1B3C2D2工藝下，100 mL的粗提液中總黃酮平均含量為9．76 mg，比試驗號3提高了0．103%，進一步確定了鳳眼蓮總黃酮提取的最佳條件是A1B3C2D2，即微波時間2 min，乙醇濃度50%，料液比1:80，微波火力M．Low。

3 討論

本文中微波法提取時間比文獻熱水浸提法、超聲波法明顯縮短(余芳麗等，2008)，原因可能是微波火力比超聲波猛烈，很快就能提取出大量總黃酮，比較節省時間。目前天然產物總黃酮的提取對熱水浸提法和超聲波法報道較多，微波法提取時間短，對器皿的要求也不高，具有較高的研究價值。對微波法的正交試驗探討，得出最佳條件是A1B3C2D2與單因素試驗最佳條件很接近，只是在微波時間上略有不同。

1．確定了以蘆丁標準品為對照品的可見分光光度計法測定總黃酮含量，其檢測波長為510 nm;回歸方程為:A=0．00128+10．75625C，相關系數 R=0．99968。

2．通過對影響總黃酮的因素進行微波正交試驗和影響因素分析，結果表明乙醇提取鳳眼蓮中總黃酮的微波法最佳工藝條件為:微波時間2 min，乙醇濃度50%，料液比1:80，微波火力M．Low。

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