基于mtDNA COI序列的福建B型煙粉虱田間種群分析

鄭 宇，趙建偉，何玉仙，翁啟勇，黃 建

(1．福建農業科學院植物保護研究所，福建福州350013;2．福建農林大學植物保護學院，福建福州350002)

我國煙粉虱的發生記錄最早始于1949年(周堯，1949)，后由于外來生物B型煙粉虱入侵，在我國嚴重發生是最近十多年時間(張芝利等，2001)。福建省煙粉虱暴發始于本世紀初，開始于福建南部地區，隨后范圍迅速擴散(何玉仙等，2005)。本課題成員于2005和2009年對福建省煙粉虱田間種群的生物型鑒定、抗藥性監測表明，福建省各地區煙粉虱田間種群為B生物型。對常規化學藥劑均產生了一定水平抗性，對煙堿類農藥抗性發展尤為迅速。通過抗藥性不同影響因子分析證實了化學藥劑脅迫是煙粉虱抗藥性水平迅速發展的關鍵因子(何玉仙等，2007;鄭宇等，2012)。而不同的藥劑選擇壓力(脅迫)是影響昆蟲抗藥性水平差異的一個重要原因(唐振華等，1999)。殺蟲劑脅迫又可能導致種群遺傳變化，這是由于抗性個體遷移導致種群間基因交流、種群遺傳結構發生變化。臧連生等(2006)和Zhang等(2004)都證實入侵我國的B型煙粉虱抗性種群與敏感種群在DNA水平上已存在明顯分化，不同抗性水平的煙粉虱種群其遺傳結構有較大差異。

為了進一步闡明我省煙粉虱在藥劑選擇壓力下的群體變化和進化趨勢，從不同地理種群的遺傳特征分析可以有助于我們從群體水平來理解和分析。而昆蟲群體中的遺傳變異或多態性最終都是其DNA序列的差異或多態性，通過DNA序列分析我們可以檢測到序列中不同堿基替換、插入和缺失等變異信息，從而在分子水平上檢測出群體及種間的多態與遺傳差異。而昆蟲線粒體DNA序列分析是最有效的方法之一，其中線粒體COI(mtDNA COI)基因進化速度適中，一個較短的基因片段就包含從種水平乃至科水平的系統發育信息(Moritz et al．，1987)。在國內外mtDNA COI基因已被用來研究煙粉虱的系統發育關系，該基因差異能有效反映煙粉虱生物型的地理模式，被大量用來分析煙粉虱復合種不同地理種群的遺傳分化等(Frohlich et al．，1999;褚棟等，2005a、2005b、2006)。本課題主要利用的 mtDNA COI分子標記技術，通過與其它地區不同地理煙粉虱種群比較，探討福建地區煙粉虱地理種群遺傳特征，進一步了解在環境選擇壓力下種群遺傳變異和分化趨勢，為揭示煙粉虱成功入侵并暴發成災的原因，為煙粉虱預防、可持續控制與管理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1．1 供試蟲源

從福建省8個具有代表性的地理區域采集10份煙粉虱樣品，經過測序確定為B型煙粉虱后，作為測定蟲源(鄭宇等，2012)。挑選煙粉虱雌成蟲，-20℃下用無水乙醇保存，作為煙粉虱DNA提取蟲樣。記錄煙粉虱樣品采集時間、地點和寄主(表1)。

1．2 煙粉虱DNA方法提取與檢測

直接采用昆蟲DNA提取試劑盒(上海生工)提取。得到的DNA用30 μL TE溶解。用Thermo核酸蛋白檢測儀檢測其濃度和純度，并稀釋至10 ng·μL-1低溫保存待用。

1．3 PCR引物與擴增條件

所用引物和反應程序參照(羅晨，2002)，PCR產物以1．2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在伯樂紫外儀上觀察，記錄結果。引物 C1-J-2195(5＇TTBATTTTTTGGTCATCCAGAAGT3＇)和R2819(5＇CTGAATATCGAGGCATTCC3＇)，擴增產物大小為 600 bp 左右。

1．4 序列分析與數據處理

對樣品進行了正反鏈測序。由DNAstar軟件包對樣品序列進行分析和調整。再使用DNASP5．0軟件統計序列，計算單倍型多態度、核苷酸多樣性;單倍型數目等。

1．5 聚類分析

基于Kimura-2-Parameter雙參數模型，在Mega5．0軟件中用UPGMA法構建單倍型分子系統樹。

表1 不同煙粉虱種群的地點、生物型、寄主、試驗個體數量以及采集時間Table 1 Sampling location，sample name，hosts and sampling time of B．tabaci collected from different places

2 結果與分析

2．1 福建群體與其它三個地理種群遺傳特征分析

本實驗共分析了福建煙粉虱不同地理群體10個個體，mtDNA COI序列經比對目的片段長為592 bp。利用DNAsp5．0軟件進行序列分析發現10個煙粉虱中共鑒定出10種單倍型，單倍型比率100．0%，單倍型多樣度Hd=1．0。變異位點(variable site)為26個，變異位點比率4．39%，其中簡約信息位點(parsimony information site)20個，變異比率為3．37%;核苷酸多樣性 pi=0．021(表 2)。

表2 煙粉虱不同地理種群的單倍型多樣性h和核苷酸多樣性piTable 2 Haplotype diversity and Nucleotide diversity of different geographical populations of B．tabaci

另外從NCBI數據庫中篩選出符合同一地區、同一時間、樣本數較多的3個B型煙粉虱不同地理種群mtDNA COI序列，分別為埃及(EGT)，湖北(HB)和武漢(WH)，進行mtDNA COI序列比對分析。其中埃及種群6個個體共鑒定出6種單倍型，單倍型比率100．0%，單倍型多樣度Hd=1．0。變異位點12個，變異位點比率1．36%，其中簡約信息位點5個，變異比率0．057%，核苷酸多樣性pi=0．00676;湖北種群7個個體共鑒定出2種單倍型，單倍型比率28．6%，單倍型多樣度Hd=0．286。變異位點(variable site)4個，變異位點比率0．453%，其中簡約信息位點0個，變異比率0%;核苷酸多樣性pi=0．0015;武漢種群6個個體共鑒定出1種單倍型，單倍型比率0．0%，單倍型多樣度Hd=0．0。無變異位點和變異位點比率，核苷酸多樣性pi=0(表2)。結果表明無論是核苷酸多樣性、核苷酸變異比率、單倍型比率、單倍型多樣性，福建地區B型煙粉虱種群數值最高，表明其遺傳多樣性最為豐富。

2．2 不同地理種群的系統進化樹

不同地理種群的UPGMA系統進化樹(圖1)，形成了兩大枝，第一大枝由福建、武漢和湖北種群構成;第二大枝由埃及種群組成。第一枝又分為2個小組，一組由福建和武漢種群組成，另一組由湖北種群組成。從遺傳距離看(表3)，埃及種群與其它3個地理種群距離最遠，為1．194-1．911之間，而國內3個地理種群遺傳距離比較接近，為0．005-0．202之間，種群相似度較高。以上說明埃及群體與中國三個群體的遺傳背景有所不同，地理距離與群體的遺傳距離存在一定的相關性。另外，福建地理種群分布在國內群體的不同分支內，說明其在群體遺傳結構上較大遺傳差異，有更為豐富的遺傳多樣性。

表3 煙粉虱四個不同地理種群的遺傳距離Table 3 The genetic distance for 4 different geographical populations of B．tabaci

2．3 不同地理種群遺傳變異

對4個群體的遺傳結構進行分析(表4)，顯示60．9%的遺傳差異來自于群體間，39．1%的遺傳差異來自于群體內，差異極顯著(P=0．000)。

表4 煙粉虱四個群體內和群體間的變異Table 4 Variation among populations and within 4 geographical populations of B．tabaci

3 討論

本文通過對福建B型煙粉虱不同田間種群的mtDNA COI進行測序，并與其它地理B型種群比較，結果在核苷酸多樣性、單倍型比率、單倍型多樣度等方面，福建煙粉虱種群表現最高，說明福建田間種群的遺傳多樣性更為豐富，種群分化更為明顯，聚類分析也表明福建地區的種群遺傳結構變化較大。

我們知道煙粉虱自然種群遺傳結構變化受多方面條件影響，除自身群體的遺傳特性外，不同生態環境條件下都可能是誘導煙粉虱遺傳分化的因子。Zhang等(2005)就證實寄主植物是誘導煙粉虱遺傳分化的重要因素，B型煙粉虱的遺傳分化與受寄主脅迫的時間和強度成正相關。其它環境因子如溫度等亦能影響其遺傳分化(Zhang et al．，2005;褚棟等，2006)。這些都是煙粉虱對不同生境的適應反應，從群體上表現出不同的遺傳變化。結合以往研究，近年來福建地區煙粉虱種群抗藥性水平上升十分迅速，不同地理種群抗性水平差異也較大，這與不同化學藥劑的施藥水平和脅迫壓力密切相關(鄭宇等，2012)。煙粉虱在殺蟲劑的選擇下，抗性個體遷移導致種群間基因交流、種群遺傳結構發生變化。研究證實，化學藥劑的不合理使用能導致B型煙粉虱種群抗藥性水平迅速提高，而其種群的遺傳結構也發生快速演變和分化。臧連生等(2006)和Zhang等(2004)都證實入侵我國的B型煙粉虱抗性種群與敏感種群在DNA水平上已存在明顯分化，不同抗性水平的煙粉虱種群其遺傳結構有較大差異。可以推測，在福建地區煙粉虱田間種群遺傳結構不可避免受到化學藥劑脅迫影響，而這種影響又是深刻、長遠的。

圖1 由COI序列得到的UPGMA系統樹Figure 1 UPGMA phylogenetic tree based on COI sequences

B型煙粉虱能夠在我國成功入侵并為害巨大，除了與該種群對土著種競爭取代(Reitz and Trumble，2002)和生態環境(包括寄主植物、氣候因子、越冬場所等)的適應能力密切相關外(Drost et al．，1998;張芝利，2000)，另一個重要影響因素就是B型煙粉虱抗藥性水平在其入侵、擴散過程中也起到了重要的作用(Byrne et al．，2000;Riley and Tan，2002)。結合我省煙粉虱種群抗藥性監測和抗藥性水平發展的情況(何玉仙等，2007;鄭宇等，2012)，可以推測在環境脅迫下，如殺蟲劑壓力選擇下，我省田間煙粉虱種群開始出現比較明顯的抗性遺傳分化，以適應不利環境，這對今后我省煙粉虱防治工作是一個重要警示。

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