維C銀翹片微生物限度檢查方法的建立

董 琪趙 楠

（1寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬總醫(yī)院藥劑科，銀川750004；2寧夏中衛(wèi)市食品藥品監(jiān)督管理局，中衛(wèi)755000）

維C銀翹片是由山銀花、連翹、荊芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、薄荷油、蘆根、淡竹葉、甘草、維生素C、馬來(lái)酸氯苯那敏、對(duì)乙酰氨基酚等13味藥組成的中藥制劑，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的作用。用于治療外感風(fēng)熱所致的流行性感冒，癥見(jiàn)發(fā)熱、頭痛、咳嗽、口干、咽喉疼痛。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版微生物限度檢查法的要求[1]，為了確保方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本文對(duì)維C銀翹片的微生物限度檢查法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，建立了該品種微生物限度檢查的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 高壓滅菌器、恒溫恒濕培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63 501]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌(Aspergillusnier)[CMCC(F)98003]，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養(yǎng)基與試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(060311)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(050824)、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。膽鹽乳糖增菌液(BL增菌液)(05092)，MUG培養(yǎng)基(050314)，靛基質(zhì)試劑，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 ①分別取經(jīng)36℃培養(yǎng)18～24小時(shí)的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌肉湯培養(yǎng)物1ml，加9ml鹽水10倍稀釋至10-5～10-7，約為50～100個(gè)/毫升，做活菌計(jì)數(shù)備用。②取經(jīng)25℃培養(yǎng)18～24小時(shí)的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1ml，加9ml鹽水10倍稀釋至10-5～10-7，約為50～100個(gè)/毫升，做活菌計(jì)數(shù)備用。③取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5ml鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，與濁度相當(dāng)后，取1ml霉菌孢子液加9ml鹽水稀釋，逐管10倍稀釋為10-4，約為50～100個(gè)/毫升，做活菌計(jì)數(shù)備用[2]。④樣品的制備：稱取樣品10g，加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml制成1:10供試液。

2 驗(yàn)證方法及結(jié)果

2.1 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 （常規(guī)法）

2.1.1 試驗(yàn)組 取1：10供試液1ml和50～100 cfu/ml的各試驗(yàn)菌株，分別同時(shí)加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基（每個(gè)試驗(yàn)菌平行制備兩個(gè)平皿），待凝固后，置于規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72小時(shí)觀察結(jié)果。

2.1.2 菌液組 測(cè)定每一菌株加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.1.3 供試液對(duì)照組 取1:10供試液1ml，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。本品供試液制備時(shí)不需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊處理，因此未做稀釋劑對(duì)照組。

2.1.4 回收率的計(jì)算 回收率%=[（實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)]×100%。

2.1.5 常規(guī)法計(jì)數(shù)方法實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 常規(guī)法（1毫升/皿）各菌平均回收率 （%）

結(jié)果表明，維C銀翹片的白色念珠菌試驗(yàn)的回收率均高于70%，而大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌試驗(yàn)組回收率基本均低于70%。表明該供試液對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌有抑菌活性，細(xì)菌計(jì)數(shù)采用常規(guī)法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，試驗(yàn)方法不成立，應(yīng)建立新的方法，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)采用常規(guī)法的試驗(yàn)方法亦不成立。

2.2 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 （培養(yǎng)基稀釋法）

2.2.1 試驗(yàn)組 取1:10供試液1ml和50～100 cfu/ml的大腸埃希菌液1ml，分別等量注入5個(gè)平皿中，每個(gè)平皿各0.2ml，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備3份，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72小時(shí)觀察結(jié)果。

2.2.2 供試液對(duì)照組 培養(yǎng)基稀釋法：取1：10供試液1ml，分別等量注入5個(gè)平皿中，每個(gè)平皿0.2ml，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備3份，備用。

2.2.3 回收率的計(jì)算 同常規(guī)法。

2.2.4 培養(yǎng)基稀釋法細(xì)菌計(jì)數(shù)法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)3批維C銀翹片按照培養(yǎng)基稀釋法（0.2毫升/皿）進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌試驗(yàn)組和稀釋劑對(duì)照組回收率均高于70%，表明該供試品采用培養(yǎng)基稀釋法0.2毫升/皿進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，試驗(yàn)方法成立。

2.3 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)組 取3批維C銀翹片1:10供試液10ml和10～100 cfu試驗(yàn)菌大腸埃希菌液加入100ml膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)基中，作為大腸埃希菌試驗(yàn)組。

2.3.2 陰性菌對(duì)照組 設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的專屬性：取1：10供試液10ml和10～100 cfu試驗(yàn)菌金黃色葡萄球菌液加入膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)基中， 方法同試驗(yàn)組。

2.3.3 控制菌檢查方法的驗(yàn)證結(jié)果 見(jiàn)表 2。

表2 控制菌驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，3批維C銀翹片實(shí)驗(yàn)組均檢出大腸埃希菌，陰性對(duì)照組均未檢出金黃色葡萄球菌，表明常規(guī)法可用于該品種的控制菌檢查。

3 結(jié)論

因維C銀翹片中成藥組方中的部分中藥材，如山銀花等具有較強(qiáng)抑菌作用，對(duì)這些藥品進(jìn)行微生物檢查時(shí)，需要有效地消除樣品本身的抑菌作用，使被檢微生物能夠正常繁殖。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，本文建立了維C銀翹片微生物檢查的方法：維C銀翹片細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2毫升/皿）進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)方法成立。控制菌檢查采用常規(guī)法，實(shí)驗(yàn)方法成立。通過(guò)以上方法的建立，解決了藥物抑菌成分的存在對(duì)微生物限度檢查產(chǎn)生的干擾，能夠真實(shí)、客觀地反映出藥物的染菌情況，使檢查結(jié)果更加科學(xué)、準(zhǔn)確、可信。

[1]中華人民共和國(guó)藥典編委會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2010版一部）[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄79.

[2]馬緒榮,蘇德模 .藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2000:248,256.