膽堿能M受體信號通路在芍藥苷抗腦缺血神經保護中的作用

王國峰，尹魯平，趙 霞，陳冬梅

(1.濟南軍區總醫院干部病房三科，山東 濟南 250031;2.中國科學院生物物理所腦與認知科學中心，北京 100101)

腦卒中(stroke)是以局灶性神經功能缺失為共同特征，或伴發意識障礙的急性腦血管疾病。缺血性腦卒中(ischemic stroke)是最常見腦卒中類型，有關腦缺血病理機制的學說眾多，如興奮性氨基酸釋放增多、細胞內鈣超載、代謝性酸中毒等，但據此采取的治療措施均不能獲得理想療效，尚缺乏有效的治療藥物。

芍藥苷(paeoniflorn，PAE)是傳統中藥處方芍藥根的主要成分，具有抗氧化、增強認知功能及內皮依賴性舒張血管等藥理活性［1－3］。既往研究表明，PAE可通過激活腺苷Al受體，并抑制與之偶聯的MAPK通路，阻斷花生四烯酸通路炎癥蛋白COX-2和5-LOX在腦缺血中過度表達，模擬缺血預適應(ischemic preconditioning，IPC)誘導藥理預適應發揮延遲神經保護作用［4］。

本文在上述基礎上進一步研究PAE對腦缺血的治療作用及其對M受體信號通路的調節機制，旨在為腦卒中的治療提供新靶點、新策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康♂大鼠(Sprague-Dawley，鼠齡60～90 d，體質量220～250 g)由中國科學院上海實驗動物中心提供［SPF級，合格證書號:SCXK(滬)2002-0010］。

1.2 藥品與試劑 PAE(純度98.5%):購于中國藥品與生物制品檢定所。2，3，7-三苯基氯化四氮唑(TTC)購自 Sigma(Aldrich，St Louis，USA);TRI-REAGENT-LS試劑盒購自 Molecular Research Center，Inc.(Cincinnati，USA);RNasin、dNTP、Oligo(dT)18引物和 DNA polymerase購自 Sangon Biotechnology Co.(Shanghai，China);M-MuLV 逆轉錄酶購自 Fermentas，Inc.(Vilnius，Lithuania);DNA 熒光染 料SYBR Green I購自 Roche Co.(Mannheim，Germany);其它均為國產分析純試劑。

1.3 實驗分組 ① 模型組:MCAO(90 min)，再灌注(24 h)，缺血同時給予生理鹽水(2 ml·kg－1，ip，14 days，每天兩次)，即從缺血計算為0時，大腦中動脈梗死90 min后拔出絲線再灌24 h;于缺血0時給予生理鹽水，連續14 d;② PAE治療組:MCAO(90 min)，再灌注(24 h)，缺血同時給予PAE(2.5、5、10 mg·kg－1，ip，14 d，每天兩次);③ 假手術組。n=8。大鼠生理指征如血氧、血糖等于MCAO前、MCAO過程中及再灌后30 min分別測定，實驗過程中動物體溫始終維持(37±1)℃。

1.4 大腦中動脈梗死模型的建立 參考Takano模型［5］，采用可逆性大鼠大腦中動脈栓塞法造成局灶性腦缺血模型。以水合氯醛(300 mg·kg－1，ip)麻?醉大鼠，頸部切口，游離頸外動脈，遠端結扎。取頭端呈圓球狀4#尼龍線，由頸外動脈根部經頸內動脈向前延伸，插入約20 mm，遇到阻力停止。栓塞90 min后拔出栓線，再灌注24 h。

1.5 神經體征評分標準 根據 Sydserff等［6］神經體征評分:無明顯體征(0分);將大鼠懸空觀察，其損傷對側前肢屈曲(1分);損傷對側據抗推力下降(2分);提尾向損傷的對側轉圈但自由行走時不轉圈(3分);自發性向損傷對側轉圈(4分)。

1.6 TTC染色后腦梗死體積的測定 將大鼠斷頭后，立即取出大腦，置－20℃約15 min，大腦作連續冠狀切片(片厚2 mm)。腦片置于1%TTC(pH 7.2)37℃孵育10 min染色，10%甲醛溶液固定。數碼相機拍照，測定腦梗死體積。

1.7 逆轉錄－多聚酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 采用RT-PCR技術對mRNA表達進行定量。再灌注24 h后分離皮層、海馬和紋狀體。TRIzol提取總RNA，逆轉錄反應液中如下:3 μl(1 μg)總RNA提取液，2 μl 10 mmol·L－1dNTPs，1 μl(1.6 μg)Oligo(dT)18作為引物，1 μl(20 U)RNase抑制劑(Promega，USA)，1 μl(20 U)M-MuLA 反轉錄酶及 4 μl 5 ×buffer。反應條件為:變性(94℃，30 s)，退火(68℃，30 s)，延伸(72℃，45 s)，共35個循環。以2%瓊脂糖電泳分離，溴乙啶染色后用凝膠分析儀觀察，以看家基因β-actin作為內參，計算相對光密度值。

2 結果

2.1 PAE對腦梗死體積及神經功能缺陷的影響

PAE對腦缺血/再灌注損傷(I/R)的治療學作用如Fig 1 所示，PAE 在2.5、5 和10 mg·kg－1劑量14 d 治療后，腦梗死體積分別降低為模型組的0.64倍、0.5倍及0.48倍(P＜0.01);神經功能評分分別降低為模型組的0.35倍、0.3倍和0.3倍(P＜0.01)。提示PAE對腦缺血/再灌注損傷具有良好治療學作用。

2.2 對M受體基因表達的影響 PAE對不同腦區I/R后M受體基因表達的影響如Fig 2所示。在皮層、海馬和紋狀體，PAE治療性給藥14 d后與模型組相比，使M1受體基因表達分別增加1.78倍、1.87倍和1.58倍(P＜0.01);使M3受體基因表達分別增加3.5倍、3.2倍和3.07倍(P＜0.01);使M5受體基因表達分別增加3.9倍、1.6倍和1.38倍(P＜0.01)。

Fig 1 Effects of PAE on the size of cerebral infarct measured by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining after transient MCAO followed by reperfusion(±s，n=8)

進一步研究了PAE對突觸前M2和M4基因表達的影響。在皮層和海馬，PAE治療性給藥14 d后與模型組相比，使M2受體基因表達分別降低3.38倍和1.28倍(P＜0.01);在皮層、海馬和紋狀體，使M4受體基因表達分別增加2.05倍、1.55倍和1.23倍(P＜0.01)。

2.3 對G蛋白基因表達的影響 進一步研究了I/R及PAE治療對與不同亞型M受體相偶聯的G蛋白基因表達影響(Fig 3)。在3個腦區，I/R可誘導與M2和M4相偶聯的Gi蛋白基因表達增高，PAE治療給藥14 d后抑制該病理性改變(P＜0.01);I/R和PAE對與M1、M3和M5相偶聯的Gαq/11基因表達的影響與此相反。

Fig 2 Effects of PAE on M1～M5(A～E)muscarinic receptors gene expression after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

2.4 對ATP敏感性鉀通道基因表達的影響 I/R可誘導Kir6.1基因表達上調及Kir6.2表達下調，導致Kir6.2/Kir6.1比值在腦缺血時下調，PAE逆轉該病理改變(P ＜0.01，Fig 4)。

Fig 3Effects of PAE on Giα and Gq/11α gene expression after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

3 討論

3.1 調節M受體基因表達，促進興奮性突觸傳遞為其抗腦缺血新機制 根據M受體i3環結構、信號轉導途徑和生物效應的差異，M受體被分為2類。M1、M3和M5主要通過G蛋白－磷脂酶C-二酰基甘油/三磷酸肌醇(Gq-PLC-DAG/IP3)通路起作用，為M1組;M2和 M4激活 Gi/o-腺苷酸環化酶(AC)-cAMP信號通路，為M2組。中樞M1大量表達于皮層、海馬和紋狀體，通過影響皮層和海馬之間的交互活動發揮調節記憶、學習等高級認知功能;M2主要分布在海馬、腦干、丘腦等區域膽堿能神經元突觸末梢，調控中樞乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)釋放;M4主要表達于紋狀體內，與多巴胺(DA)受體共存，抑制紋狀體內DA釋放、調控ACh介導的運動能力;M5全腦表達量不足2%，主要在海馬及黑質DA能神經元表達［7］，腦微血管內皮細胞M5的激活介導大腦中動脈血管舒張反應，增加腦血流供應，M5基因敲除小鼠喪失腦血管舒張功能，對腦缺血損傷易感性增高［8］。

有報道，腦缺血1～3周后，腦血流明顯降低，缺血的皮層M1受體數目降低，M受體結合力減弱［9］;雙側頸動脈結扎誘導的腦缺血小鼠，皮層M3、M5受體及膽堿乙酰基轉移酶(ChAT)的mRNA表達降低［10］。但有關M受體及其信號轉導系統與腦缺血的關系尚無系統報道。本文基于已有報道，系統研究了不同M受體亞型及其信號通路在腦缺血中的改變，并進一步探討PAE的神經保護機制。

M1、M3和M5受體調節興奮性突觸傳遞，而M2和M4調節抑制性突觸傳遞。PAE可上調腦缺血/再灌注損傷誘導的M1組受體-M1、M3和M5基因表達，逆轉腦缺血誘導的與M1組受體偶聯的Gα/11基因表達的降低，從而促進PLC生成，激活 IP3/Ca2+，升高胞內Ca2+濃度產生神經保護作用。與此相反，PAE下調腦缺血誘導的突觸前M2受體基因表達，抑制其負反饋調節，從而促進ACh的釋放，產生興奮性突觸效應，發揮神經保護作用;有報道M4受體位于海馬的興奮性突觸末梢，海馬腦片缺氧再灌注24 h后，CA1區M4受體的mRNA表達消失，谷氨酸能突觸傳遞功能降低，與此同時觀測到的M受體介導的興奮性神經遞質釋放減弱相一致［11］(海馬腦片再灌注20 h后，氨甲酰膽堿可抑制CA1區EPSP的生成)，因此，PAE對M4亞型的調節與M2相反，可明顯抑制腦缺血誘導的M4受體基因表達的降低。

由此可見，PAE對M受體及其信號通路調節，最終產生共同效應，即促進興奮性突觸傳遞而發揮神經保護作用。

Fig 4 Effects of PAE on ATP-sensitive potassium(KATP)channel:Kir6.1，Kir6.2 gene expression and Kir6.2/Kir6.1 ratio after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

3.2 增加Kir6.2/Kir6.1比值為其發揮神經保護作用新途徑 ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)由內向整流 K+通道家族(Kir6.1和 Kir6.2)及硫脲受體異構體(SUR1、SUR2A和SUR2B)組成，其開放是缺血預適應重要神經保護機制。大量研究表明KATP開放劑可明顯減輕腦缺血后神經功能缺損，減少腦梗死體積，并通過抑制線粒體和死亡受體信號通路減少神經元凋亡，對腦缺血/再灌注損傷發揮保護作用［12］。海馬CAl區對缺氧極為敏感，缺氧激活K+內流使細胞膜超極化，阻止Na+、Ca2+超載，細胞膜去極化和胞膜降解，而KATP有助于K+內流的激活。Kir6.2基因敲除小鼠在發生腦缺血15 min后即出現嚴重神經功能缺失癥狀，梗死體積明顯大于Kir6.2(+/+)野生型小鼠，體外細胞試驗也證實了這一點［13］;心肌缺血60 min/再灌注24 h的犬，心肌線粒體中Kir6.1蛋白表達水平上調［14］;離體培養的胎鼠前腦皮層神經元，以 Aβ1-42處理24 h后，免疫組化和Western blot研究均證明Kir6.1表達明顯增加，而KATP開放劑二氮嗪則抑制其蛋白表達［15］。本研究也證實腦缺血可誘導Kir6.2基因表達下調及Kir6.1基因表達的上調，故Kir6.2/Kir6.1比值降低;PAE逆轉上述病理改變，增加Kir6.2/Kir6.1比值，激活KATP通道發揮神經保護功能。

綜上所述，芍藥苷通過調節M受體—G蛋白—KATP通道發揮神經保護作用，具有發展為安全、有效、機制新穎的抗腦缺血候選藥物應用前景。

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