鞘內注射甘珀酸對腰5脊神經切斷大鼠痛覺高敏的影響

李雪飛，許 倩，許佩龍，謝文強，王洪超，李偉偉，劉 健，李偉彥

(1.南方醫科大學南京臨床醫學院，2.南京軍區總醫院麻醉科，江蘇 南京 210002)

越來越多的研究發現星形膠質細胞的活化在神經病理性疼痛的維持起著重要的作用［1］，但星形膠質細胞的活化機制目前仍不清楚。縫隙連接是細胞間直接進行物質和信息交換的唯一通道，星形膠質細胞之間存在廣泛的縫隙連接［2］，因此有學者提出縫隙連接可能參與了神經病理性疼痛時星形膠質細胞的活化［3］。甘珀酸(carbenoxolone，CBX)是常用的縫隙連接阻滯劑，本實驗通過單次鞘內注射大劑量CBX，觀察其對SNT大鼠損傷側機械痛敏，以及損傷側脊髓背角 GFAP和 TNF-α、IL-1β表達的影響，來探討縫隙連接是否參與了神經病理性疼痛時星形膠質細胞活化。

1 材料與方法

1.1 動物模型 體質量160～180 g的成年♂Sprague-Dawley大鼠36只(由南京軍區總醫院比較醫學科提供，清潔級)，單籠飼養。動物飼養室溫為 (23±3)℃，周期光照8:00～20:00，大鼠自由進食，飲水。所有實驗均在光照期間完成。以2%的戊巴比妥(Sigma公司，美國)50 mg·kg－1腹腔注射麻醉，根據Kim等的方法［4］創建模型。

1.2 藥物及分組 甘珀酸(Sigma，美國);兔抗大鼠膠原纖維酸性蛋白(anti-glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(Sigma，美國);ELISA試劑盒。所有動物隨機分成3組:假手術組(Sham組)、生理鹽水組(NS組)、SNT+CBX 5 μg組(CBX 組)。

1.3 鞘內注射 參照Mestre等［5］所建立的方法。大鼠麻醉后用連有PE-10導管的稍鈍針頭經腰5(L5)和腰4(L4)錐間隙行椎管穿刺，以動物出現突然地側向甩尾運動作為穿刺成功的標志，鞘內注射采用微量進樣器進行。術后10 d，Sham組和NS組鞘內注射 10 μl NS，CBX 組大鼠鞘內注射 10 μl CBX，濃度0.5 g·L－1甘珀酸的劑量選擇參考既往文獻。

1.4 機械痛閾的測定 3組大鼠隨機取6只于術前1 d，術后 1、3、5、7 d 及術后 10 d 給藥前，給藥后1、2、4、6 h 測定損傷側后肢機械痛閾(MWT)。MWT測定:將大鼠分別放置于金屬篩網上的有機玻璃箱里，安靜15 min，以Von Frey纖維垂直刺其左右后肢足底中部皮膚，持續≤4 s，大鼠出現抬足，舔足，躲避等反應時，記錄Electrovon Frey讀數器上顯示的最大值(g)，每只老鼠重復測量5次，間隔5 min，去除最大和最小值計算3次的平均值即為大鼠的MWT值。

1.5 免疫組織化學染色 3組大鼠術后10 d鞘內注射CBX 2 h后，分別取3只按以下方法取材檢測。2%的戊巴比妥鈉50 mg·kg－1經腹腔注射麻醉，開胸后經左心室插管至升主動脈，依次灌注生理鹽水250 ml、4% 多聚甲醛(pH 7.4)400 ml、PBS 緩沖液250 ml約1 h后取大鼠腰膨大脊髓，于上述固定液中固定24 h。經梯度乙醇脫水，二甲苯透明石蠟包埋，進行連續切片，片厚40 μm，每個蠟塊連續切5片。以ABC法作GFAP免疫組化染色。染片用半自動圖像分析儀進行圖像分析，計算各切片損傷側GFAP陽性細胞數表示星形膠質細胞表達的強度。胞質出現棕黃色顆粒沉積為GFAP免疫組化陽性反應細胞。

1.6 TNF-α和IL-1β水平檢測 ELISA測定損傷側脊髓TNF-α和IL-1β濃度。按照試劑盒中說明書操作，并在波長為450 nm，參考波長為620 nm處，用酶標儀(美國Bio-Rad公司)測定光密度，根據標準曲線算出TNF-α和IL-1β濃度。

2 結果

2.1 MWT測定結果 術前1 d，3組大鼠MWT差異均無顯著性(P＞0.05)。與術前相比，Sham組各時間點損傷側MWT差異無顯著性(P＞0.05)。與Sham 組相比，NS 組和 CBX 組術后1、3、5、7、10 d 痛閾下降(P＜0.05)。與術后10 d給藥前1 h相比，NS組給藥后1、2、4、6 h的MWT值差異無顯著性(P＞0.05)。與 NS 組相比，CBX 組術后1、3、5、7 d 及10 d給藥前MWT與其差異無顯著性(P＞0.05)，但給藥后1、2、4 h損傷側MWT較給藥前明顯提高(P＜0.05)，但6 h時差異無顯著性(P＞0.05)，見Fig 1。

2.2 GFAP測定結果 NS組損傷側脊髓背角GFAP染色較Sham組有明顯的增強，CBX組損傷側脊髓背角GFAP染色較Sham組略有增強，但較NS組染色明顯減弱(Fig 2)。NS組損傷側脊髓背角GFAP陽性細胞數較Sham組均明顯升高(P＜0.05)，CBX組損傷側脊髓背角GFAP陽性細胞數較NS組明顯降低(P＜0.05)，見Fig 3。

Fig 1 Intrathecal administration of CBX affects SNT-induced mechanical allodynia

2.3 TNF-α和IL-1β測定結果 NS組損傷側脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平較Sham組均明顯上升(P＜0.05);CBX組損傷側脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平較NS組明顯下降(P＜0.05)。見Tab 1。

Tab 1 The changes of TNF-α and IL-1β in the spinaldorsal horn in the three groups(±s，ng·g－1)

Tab 1 The changes of TNF-α and IL-1β in the spinaldorsal horn in the three groups(±s，ng·g－1)

2 h after intrathecal injection NS and CBX，the expression of TNF-α and IL-1β in the ipsilateral spinal dorsal horn in NS group were significantly increased compared with those in group sham(*P ＜0.05).Compared with group NS，the expression of TNF-α and IL-1β in the spinal dorsal horn in CBX group was significantly decreased(#P ＜0.05).

Group TNF-α IL-1β Sham 9.68 ±2.91 25.73 ±2.73 NS 148.43 ±9.92* 317.30 ±22.97*CBX 69.15 ±9.27*# 140.06 ±19.84*#

3 討論

越來越多的研究證實，神經損傷或炎癥后脊髓的小膠質細胞、星形膠質細胞相繼活化，通過釋放促炎細胞因子、趨化因子、前列腺素、一氧化氮，或者影響脊髓內重要神經遞質谷氨酸的轉運平衡［6－7］，導致了痛覺傳遞通路神經元的高興奮性，從而誘導和維持了慢性神經病理性疼痛，其中星形膠質細胞在疼痛的維持中發揮重要作用。采用非特異性的膠質細胞抑制劑如:氟代檸檬酸、丙戊茶堿、米諾環素、己酮可可堿等，可明顯地緩解神經病理性疼痛動物模型的痛覺高敏［8－10］，因此調控神經膠質細胞，尤其是星形膠質細胞的活性是神經病理性疼痛研究的一個重要方向。

Fig 2 GFAP expression in the dorsal horn of the spinal cord in rats

Fig 3 Changes of number for astrocytic activation marker GFAP in the rats spinal cord of each group

縫隙連接在星形膠質細胞活化中的作用最近被認識。縫隙連接是相鄰細胞膜之間的連接通道，允許離子和小分子例如cAMP、IP3、ATP和小分子肽類在細胞間自由通過［11］。在生理狀態下，幾乎所有的星形膠質細胞都表達縫隙連接蛋白，通過縫隙連接的廣泛偶聯，眾多的星形膠質細胞形成了一種細胞網絡。有研究發現星形膠質細胞可對激活的神經元細胞做出快速電反應，具體表現為沿縫隙連接傳播的Ca2+波［11］。這是否意味慢性疼痛時，興奮的神經元周圍的星型膠質細胞通過縫隙連接形成的網絡，使星形膠質細胞活化擴散，從而促進了神經病理性疼痛的維持。采用縫隙連接的阻滯劑甘珀酸，既往研究探討了縫隙連接在慢性疼痛模型時星形膠質細胞活化的作用。Spataro等［12］發現鞘內注射CBX(CCI)敏，同時還能逆轉人類免疫缺陷病毒Ⅰ型 gp120(gp120)誘導產生的機械痛敏和細胞因子的釋放。Seo等［13］也發現在FeCl2誘導的缺血性疼痛模型中大鼠脊髓背角GFAP的表達明顯升高，而鞘內注射CBX能夠明顯抑制大鼠的機械痛敏。在本實驗中也發現SNT大鼠術后10 d機械痛閾明顯降低，損傷側脊髓背角GFAP的表達和細胞因子TNF-α、IL-1β的水平也明顯增加，而鞘內注射CBX后機械痛閾明顯提高，同時GFAP的表達和細胞因子TNF-α、IL-1β的表達也降低，因此我們推測縫隙連接可能是星形膠質細胞活化的一種機制，阻斷縫隙連接可抑制星形膠質細胞活化，減少促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的釋放，從而緩解了痛覺高敏。

綜上所述，鞘內單次注射5 μg甘珀酸可能明顯緩解SNT大鼠的機械痛覺高敏，該效應可能與甘珀酸阻斷脊髓后角星形膠質細胞的縫隙連接，從而抑制了星形膠質細胞活化，減少了促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的釋放有關，本研究提示縫隙連接可能是慢性神經病理性疼痛時脊髓后角星形膠質細胞活化的一個重要通路。

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